王永彬　張　璐　陳美娜　秦橋基　張學志　黃　歡

(青島大學附屬醫(yī)院急診科，山東　青島　266003)

不同劑量阿司匹林對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞血管新生功能的影響

王永彬張璐陳美娜秦橋基張學志黃歡

(青島大學附屬醫(yī)院急診科，山東青島266003)

〔摘要〕目的探討不同劑量阿司匹林對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞(CMECs)血管新生功能的影響。方法4周齡雄性SPF級SD大鼠，處死后分離右心室，提取原代心肌微血管內(nèi)皮細胞進行培養(yǎng)，依據(jù)阿司匹林濃度不同分為對照組、實驗組(1、10、100、1 000、5 000 μmol/L)，分別檢測其對CMECs的增殖能力、細胞遷移能力和纖維連接蛋白(FN)水平的影響。結果培養(yǎng)48 h后，阿司匹林1、10、100 μmol/L組與對照組比較細胞量和凋亡指數(shù)(AI)值均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，僅濃度為1 000和5 000 μmol/L組與對照組比較細胞量和AI值差異顯著(P<0.05)；劃痕實驗顯示1、10、100 μmol/L阿司匹林組的劃痕間距均顯著小于對照組，10、100 μmol/L阿司匹林組的Transwell遷移數(shù)顯著高于對照組，10、100 μmol/L阿司匹林組的成管個數(shù)顯著高于對照組，5 000 μmol/L阿司匹林組的成管個數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)，其余組的相應指標與對照組無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；FN的分析結果顯示除1 μmol/L阿司匹林組外其余濃度組均顯著高于對照組(P<0.05)。結論阿司匹林對CMECs作用低濃度時表現(xiàn)為促進細胞增殖和遷移作用，并能顯著誘導FN分泌；高濃度時表現(xiàn)為抑制增殖和遷移作用，但是對FN的分泌具有促進作用。

〔關鍵詞〕阿司匹林；心?。晃⒀軆?nèi)皮細胞；血管新生

心肌微血管內(nèi)皮細胞(CMEC)是心臟微循環(huán)的重要組成部分，占整個心臟細胞總量的1/3，可以影響心肌灌流水平〔1〕。CMECs能夠分泌一氧化氮和前列環(huán)素等舒張血管的活性物質，調(diào)節(jié)心肌組織的血氧供應平衡〔2〕。阿司匹林能夠調(diào)控內(nèi)皮祖細胞的功能〔3〕，但鮮有研究報道其對CMECs的作用。本研究旨在探討不同濃度的阿司匹林對CMECs的作用。

1材料與方法

1.1動物與試劑4周齡雄性SD大鼠，體重90～110 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證號：SYXK(蓉)2007-2002，SPF級，飼養(yǎng)于我院動物實驗中心。磷酸鹽緩沖液(PBS)、杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(含4 mmol/L谷氨酰胺和4 500 mg/ml葡萄糖)、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素溶液(含10 000 U/ml青霉素，10 000 μg/ml鏈霉素)均購自Hyclone(Logan，UT，USA)，胎牛血清(FBS)購自Gibco(Auckland，NZ)，基質膠、原位末端標記法(TUNEL)試劑盒購自BD(NJ，USA)，纖維連接蛋白(FN)ELISA試劑盒購自R&D(MN，USA)，絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT)抗體、山羊抗兔IgG二抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記均購自Abcam(MA，USA)，偏聚二氟乙烯(PVDF)膜和化學增強發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1CMECs培養(yǎng)頸椎脫臼法處死大鼠，無菌條件下分離心臟，去除心外膜，分離右心室并用PBS沖洗，剪碎后加入3 g/ml Ⅱ型膠原酶吹打混勻，8 min后加入2.5 g/L的胰蛋白酶，在37℃水浴中消化15 min，加入適量DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS和1%的青霉素/鏈霉素溶液)終止消化，轉移至離心管中1 000 r/min離心5 min，棄上清，加DMEM培養(yǎng)基重懸后接種至培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)6 h后棄去未貼壁細胞，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，其后每2 d換液1次，每4 d傳代1次。

1.2.2細胞處理和分組CMECs培養(yǎng)2～3代后，消化離心，重懸后制成細胞懸液，按實驗需求接種至細胞培養(yǎng)板上，分為實驗組和對照組，實驗組添加不同濃度(1、10、100、1 000、5 000 μmol/L)的阿司匹林，對照組僅添加培養(yǎng)基。

1.2.3CMECs的增殖能力檢測CMECs以5×103/孔接種于96孔板上，培養(yǎng)24 h待細胞全部貼壁后，按實驗分組添加不同濃度的阿司匹林及DMEM培養(yǎng)基200 μl，培養(yǎng)48 h后加入25 μl的MTT試劑，37℃反應4 h后，棄上清，用200 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解細胞內(nèi)的甲瓚，用酶標儀在490 nm波長處測量吸光度值，以對照組細胞為100%，計算其余孔內(nèi)細胞量。

1.2.4CMECs的凋亡細胞檢測10×10 mm的蓋玻片滅菌后置于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，CMECs以1×105/孔接種于24孔板內(nèi)，24 h后按實驗分組添加不同濃度的阿司匹林及DMEM培養(yǎng)基2 ml，培養(yǎng)48 h后，進行TUNEL染色，在熒光倒置顯微鏡下觀察染色結果。細胞核被4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染成藍色熒光，為有核細胞；染色陽性呈綠色熒光，為凋亡細胞。計數(shù)10個視野內(nèi)CMECs總數(shù)和凋亡細胞數(shù)的平均數(shù)，凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.5CMECs的劃痕實驗CMECs以2×105/孔接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后待細胞密度達到90%，用滅菌后的一次性1 ml吸頭在細胞生長平面上劃動，每孔劃動一次，保持每孔的劃痕長度和深度一致。劃動后去除漂浮的細胞，更換新鮮培養(yǎng)基，依據(jù)實驗設計添加不同濃度的阿司匹林，培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察劃痕間距。

1.2.6CMECs遷移能力的Transwell檢測CMECs以1×105/室接種于Transwell小室的上室，并按照實驗分組添加不同濃度的阿司匹林及DMEM培養(yǎng)基，下室中添加DMEM培養(yǎng)基和10 ng/ml血管內(nèi)皮生長因子。培養(yǎng)8 h后用多聚甲醛固定2 h，足量PBS清洗去除濾膜上沒有遷移的細胞，采用結晶紫染色，在普通光學顯微鏡下觀察并計數(shù)。

1.2.7CMECs成管能力檢測向24孔板內(nèi)以200 μl/孔添加Matrigel基質膠，按照實驗分組添加不同濃度的阿司匹林及DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CMECs 48 h后，將細胞重懸并以1×105/孔接種至已經(jīng)鋪膠的24孔板中，培養(yǎng)6 h后在普通光學顯微鏡下觀察，計數(shù)5個視野并取平均數(shù)。

1.2.8CMECs中FN水平的測定CMECs以1×105/孔接種至12孔板中，按實驗分組添加不同濃度的阿司匹林及DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清液，按照操作說明書進行ELISA檢測，用酶標儀在450 nm波長處測量吸光度值，計算各樣本中FN水平。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0進行單因素方差分析和SNK檢驗。

2結果

2.1阿司匹林對CMECs增殖和凋亡的影響成功分離培養(yǎng)得到的原代CMECs呈“鵝卵石”或“鋪路石”狀貼壁生長〔3〕，阿司匹林濃度為1、10、100 μmol/L組與對照組比較細胞量和AI值均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，僅濃度為1 000和5 000 μmol/L組與對照組比較細胞量和AI值差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.2阿司匹林對CMECs遷移能力及分泌FN水平的影響1、10、100 μmol/L阿司匹林組的劃痕間距均顯著小于對照組，10、100 μmol/L阿司匹林組的Transwell遷移數(shù)顯著高于對照組，10、100 μmol/L阿司匹林組的成管個數(shù)顯著高于對照組，5 000 μmol/L阿司匹林組的成管個數(shù)顯著低于對照組(均P<0.05)，其余組的相應指標與對照組無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CMECs中FN表達水平隨阿司匹林濃度增加而增加，除1 μmol/L阿司匹林組外其余濃度組均顯著高于對照組(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1　阿司匹林對CMECs增殖和凋亡的影響±s)

與對照組比較：1)P<0.05

表2　阿司匹林對CMECs遷移能力及分泌FN水平的影響±s)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

冠心病是我國第二順位的死亡原因，且發(fā)病率仍在不斷增加，其基本病理過程是心肌缺血，所以亦被稱為缺血性心肌病，其治療關鍵是恢復心肌的有效血液灌注，因此延長缺血心肌的存活能力，防止不可逆的損傷是治療和預防心肌缺血/再灌注損傷的關鍵〔4〕。CMECs是近年來研究發(fā)現(xiàn)的心肌微循環(huán)的重要部分，在維持心肌微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，CMECs直接接觸血液和組織細胞，受到來自血液和組織細胞的雙重調(diào)節(jié)，也是心肌細胞受損時最早且最易受損的靶細胞，CMECs的變化是心臟損傷/恢復過程的關鍵〔5〕。阿司匹林是廣泛應用于心血管疾病治療和預防的藥物，其作用機制為抑制環(huán)氧化酶(COX)、降低血栓素(TX)A2和抑制前列腺素合成達到抑制炎癥和血小板聚集的作用，因為血小板沒有細胞核，不能自行合成COX，所以阿司匹林對血小板的抑制作用持久且不可逆轉〔6〕。目前普遍認為抗血小板聚集的作用是阿司匹林保護心血管作用的主要機制，但是亦有證據(jù)顯示阿司匹林的其他效應也發(fā)揮了重要作用，如對EPCs的增殖能力、遷移能力等〔7〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對CMECs的增殖和凋亡具有一定的影響，但是僅在濃度較大的時候表現(xiàn)出顯著的效應。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞可以通過垂體生長激素的作用產(chǎn)生PGI2，可以代償性地彌補阿司匹林對COX的抑制作用。這可能是其增殖活性和AI在低濃度阿司匹林的誘導下并未表現(xiàn)出差異的解釋之一。血管新生的過程包括內(nèi)皮和基底膜的溶解連接，內(nèi)皮細胞的遷移和黏附，最終形成新的毛細血管，因此CMECs的遷移能力是其是否能夠影響血管新生功能的作用評價指標〔8〕。FN是內(nèi)皮細胞分泌的一族高分子蛋白，具有多種生物活性，能夠增強細胞間粘連及細胞與基質的粘連，是血管修復的重要因子。研究顯示血管硬化程度與FN水平具有顯著的負相關性，血漿中FN的缺乏將導致血管通透性增加，引起血漿外滲，有效循環(huán)血量降低，導致局部供養(yǎng)不足〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林同樣具有促進CMECs分泌FN的作用，且這一作用表現(xiàn)出劑量依賴性。然而阿司匹林作用的劑量-效應關系尚不清楚，有待進一步實驗驗證。

4參考文獻

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〔2015-08-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號〕R54

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2617-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.022

第一作者：王永彬(1974-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科方面的研究。