丁繼強(qiáng)，寧召鋒，李　梁，劉　霞，李瑞卿

(泰安市腫瘤防治院，山東 泰安 271000)

DNA聚合酶β高表達(dá)與食管癌放化療敏感性的臨床研究

丁繼強(qiáng)，寧召鋒，李梁，劉霞，李瑞卿

(泰安市腫瘤防治院，山東 泰安 271000)

[摘要]目的觀察DNA聚合酶β(DNA polβ)表達(dá)對食管癌放化療療效的影響。方法98例食管癌患者根據(jù)DNA polβ表達(dá)分為陰性單純放療組、陰性放化療組、陽性單純放療組、陽性放化療組4組。各組均進(jìn)行常規(guī)分割放療，2 Gy/次，5次/周，中位處方劑量60 Gy。2個放化療組放療的同時給予順鉑、5-Fu和亞葉酸鈣方案化療，于放療開始的第1、5周給予。結(jié)果陰性單純放療組、陰性放化療組、陽性單純放療組、陽性放化療組的3 a局部控制率分別為54.5%、61.5%、41.7%、53.8%，3 a生存率分為31.8%、38.4%、25.0%、26.9%。結(jié)論DNA polβ表達(dá)陰性者放療聯(lián)合化療可改善其生存。

[關(guān)鍵詞]食管腫瘤；放療；化療；DNA聚合酶β；預(yù)后

食管癌是我國常見腫瘤之一，放化療是非手術(shù)食管癌的標(biāo)準(zhǔn)治療手段[1]。臨床上相同的治療方法對不同人群療效有較大差異。DNA聚合酶(DNA polβ)是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)主要的堿基切除修復(fù)酶，參與DNA損傷的修復(fù)，在正常機(jī)體內(nèi)呈低表達(dá)，而高表達(dá)或結(jié)構(gòu)異常是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的相關(guān)因素[2]。DNA polβ表達(dá)與食管癌放化療療效的關(guān)系尚未有研究探討。本研究對2008年1月至2011年5月收治的98例食管癌患者進(jìn)行了同期對照研究，以期為臨床治療提供數(shù)據(jù)參考。

1資料與方法

1.1納入標(biāo)準(zhǔn)全部患者均在我院取活檢，病理學(xué)確診鱗癌；放療前測量食管鋇劑造影病變長度≤9 cm；無嚴(yán)重外侵或穿孔征象；無嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病及合并癥；治療前完善血常規(guī)、肝功能、腎功能、肺功能等檢查。

1.2主要試劑與儀器Trizol 試劑(美國Qiagen公司)；β-actin引物(上海寶萊生物科技技術(shù)有限公司)；PCR儀(德國Peqlab公司)；AMV、Taq酶、dNTP(美國Promega公司)；PCR引物(北京索萊寶科技有限公司)；PCR Marker(DL2000)(上海凱斯泰爾生物科技有限公司)；凝膠自動成像儀、水浴式電轉(zhuǎn)印槽、電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3患者一般資料及分組情況98例患者共分為4組，DNA polβ陰性者隨機(jī)分為常規(guī)分割放療(陰性單純放療組)和常規(guī)分割放療+化療組(陰性放化療組)；DNA polβ陽性者隨機(jī)分為常規(guī)分割放療(陽性單純放療組)和常規(guī)分割放療+化療組(陽性放化療組)。見表1。

表198例食管癌患者的一般資料

項(xiàng)目陰性單純放療組(n=22)陰性放化療組(n=26)陽性單純放療組(n=24)陽性放化療組(n=26)性別 男14161314 女8101112中位年齡62616362病變部位 頸段2313 胸上段7857 胸中段10121413 胸下段3343X線分型 髓質(zhì)型16181717 潰瘍型1211 蕈傘型2233 腔內(nèi)型2223 縮窄型1212T分期 T22232 T314151314 T469810N分期 N04243 N1～218242023TNM分期 Ⅰ1211 Ⅱ5665 Ⅲ16181720

1.4方法

1.4.1polβ mRNA檢測1)總RNA的提取:胃鏡取得組織后15 min內(nèi)即放入液氮中保存。取出食管癌組織后加入液氮在研缽中研碎，用總RNA提取試劑盒提取出總RNA，后溶于滅菌超純水中，然后用紫外分光分度計(jì)測定總RNA的濃度和純度，用瓊脂糖電泳觀察其完整性；2)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下完成逆轉(zhuǎn)錄，polβ引物上游: 5’-TTGGGTGTTTGCCAGCTTCCC-3’，下游: 5’-CTCCCAAGGGACGGATGGTG-3’，其產(chǎn)物大小為200 bp。β-actin引物上游: 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游:5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，其產(chǎn)物大小為600 bp。PCR反應(yīng)體系30 μL，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3 μL，Taq DNA聚合酶2 u，4×dNTP 0.2 mmol·L-1，0.5 μmol·L-1polβ和0.2 μmol·L-1β-actin引物。具體反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，72 ℃ 10 min；共30個循環(huán);3)產(chǎn)物經(jīng)SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)分析，以目的基因和β-actin積分灰度值的比值作為目的基因mRNA的相對表達(dá)量，后根據(jù)正常黏膜表達(dá)水平推斷，若該比值>0.446 9(可信區(qū)間為95%)為高表達(dá)，反之為低表達(dá)。見圖1。

圖1　食管癌組織不同表達(dá)PCR結(jié)果

1.4.2放療常規(guī)碘造影血管強(qiáng)化，行螺旋CT模擬定位，在TPS系統(tǒng)上勾畫靶區(qū)。腫瘤靶區(qū)(GTV)為CT顯示食管壁厚度>0.5 cm或不含氣腔的管壁直徑≥1 cm，并參考食管造影確定病變范圍。臨床靶區(qū)(CTV)為GTV頭腳方向各外擴(kuò)2 cm，四周各擴(kuò)0.5 cm，并根據(jù)解剖屏障進(jìn)行修正。計(jì)劃靶區(qū)(PTV)為CTV頭腳方向各擴(kuò)1 cm，四周均勻擴(kuò)0.5 cm。縱隔淋巴結(jié)CT診斷標(biāo)準(zhǔn)為短徑≥1 cm，食管旁、氣管食管溝等淋巴結(jié)為短徑≥0.5 cm，外擴(kuò)0.5 cm為CTV，CTV外擴(kuò)0.5 cm為PTV。2個放化療組處方劑量50.4～64 Gy/28～32次，中位劑量60 Gy。2個單純放療組為58～66 Gy/29～33次，中位劑量60 Gy。要求PTV 95%體積接受>100%的處方劑量照射，全肺V20≤30%，V5≤65%，肺平均劑量<17 Gy，心臟平均劑量≤30 Gy，脊髓最大劑量<44 Gy。

1.4.3化療采用順鉑、5-Fu和亞葉酸鈣方案，順鉑(山東齊魯制藥有限公司，批號：1WAIA0602035A)25 mg·m-2·d-1，連用3 d；5-Fu(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：H20052384)500 mg·m-2·d-1，連用5 d；亞葉酸鈣(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：06042435)200 mg，連用5 d。放療第1天同步化療，于第5周行第2周期。2個放化療組共52例患者中，有32例放療結(jié)束后又接受1～2周期化療。

1.5近期療效及毒副反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)治療結(jié)束后以鋇餐檢查和CT評價近期療效。近期療效參照實(shí)體瘤治療療效評價標(biāo)準(zhǔn)RECIST 1.1版進(jìn)行評價，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、病變進(jìn)展(PD)、穩(wěn)定(SD)。完全緩解(CR)：所有目標(biāo)病灶消失；部分緩解(PR)：基線病灶長徑總和縮小≥30%；進(jìn)展(PD)：基線病灶長徑總和增加≥20%，包括其絕對值增加5 mm或出現(xiàn)新病灶；穩(wěn)定(SD)：基線病灶長徑總和有縮小但未達(dá)PR或有增加但未達(dá)PD。以CR+PR計(jì)算總有效率。毒副反應(yīng)客觀評價參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，比較采用log rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1治療完成情況與隨訪陰性放化療組1例患者未完成放療，實(shí)際照射劑量52 Gy，其余患者均完成放療；陽性放化療組患者均完成放療。2個放化療組患者中，2周期化療完成者38例(73.07%)，1周期化療完成者14例(26.92%)。2個單純放療組患者全部如期完成放療。全部病例觀察時間16～44個月，生存時間從治療開始算起。共失訪3例，其中陰性單純放療組1例，陰性放化療組1例，陽性放化療組1例，失訪病例從失訪日期起按死亡計(jì)算，總隨訪率96.9%。

2.2近期療效見表2。

表2各組食管癌患者的近期療效比較

組別nCRPRSDPD總有效率/%陰性單純放療組222181190.90陰性放化療組264211096.15陽性單純放療組241193183.33陽性放化療組261213184.61

注：各組近期療效比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P均>0.05

2.3生存情況見表3。

表3　各組食管癌患者的生存情況比較　%

注：各組內(nèi)隨著時間的增加，局部控制率和生存率降低；各組間局部控制率越高，其生存率也越高。陽性單純放療組、陽性放化療組局部控制率和生存率均低于陰性單純放療組和陰性放化療組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P均<0.05

2.4生存曲線見圖2。

圖2　各組生存曲線比較

陰性放化療組與陰性單純放療組3 a生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性放化療組與陽性放化療組3 a生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性單純放療組與陽性單純放療組3 a生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陽性單純放療組與陽性放化療組3 a生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5毒副反應(yīng)治療過程中所有患者均未出現(xiàn)嚴(yán)重的急性毒副反應(yīng)，未出現(xiàn)Ⅱ級以上心臟、脊髓損傷及出血和穿孔。見表4。

表4各組毒副反應(yīng)發(fā)生情況比較

毒副反應(yīng)陰性單純放療組(n=22)陰性放化療組(n=26)陽性單純放療組(n=24)陽性放化聊組(n=26)χ2P放射性肺炎 Ⅰ、Ⅱ級20222124 Ⅲ級以上24320.9170.821放射性食管炎 Ⅰ、Ⅱ級16201821 Ⅲ級以上66650.4710.925骨髓抑制 Ⅰ、Ⅱ級20212320 Ⅲ級以上25164.6520.199

2.6死亡原因截止到隨訪日期，陰性單純放療組、陰性放化療組、陽性單純放療組、陽性放化療組死亡病例分為15、16、18、19例。見表5。

表5　各組死亡原因分析結(jié)果比較　n

3討論

食管癌是我國常見惡性腫瘤，居死亡原因的第4位[4]。食管癌的發(fā)生呈多因素多階段過程，可受外界因素影響，有個體易感性。而腫瘤易感性涉及多個基因位點(diǎn)和單倍體變異，與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等有關(guān)[5]。DNA polβ是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)主要的堿基切除修復(fù)酶之一，主要參與DNA損傷的修復(fù)，在正常機(jī)體內(nèi)呈低表達(dá)，而高表達(dá)或結(jié)構(gòu)異?？梢鹦迯?fù)功能障礙，造成突變基因的積累，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。有研究[6-7]報道在食管癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中存在pol基因異常。趙四敏等[8]報道食管癌組織中存在DNA polβ的突變，突變率達(dá)36%。DNA polβ的高表達(dá)或突變增加了腫瘤的發(fā)生風(fēng)險，而與腫瘤治療的相關(guān)性已有報道。杜柳濤等[9]報道高表達(dá)的polβ與腫瘤細(xì)胞抗藥性有一定關(guān)系。劉瑾等[10]報道pol Ⅰ在食管鱗癌組織中過表達(dá)，增加細(xì)胞對順鉑和放射線的抵抗性。崔杰等[11]報道polβ高表達(dá)具有更強(qiáng)的DNA氧化損傷的修復(fù)作用，增加細(xì)胞的輻射抗性。

放化療是非手術(shù)食管鱗癌的標(biāo)準(zhǔn)治療手段。同步放化療較單純放療降低死亡風(fēng)險及局部復(fù)發(fā)率，提高了生存率[12]。食管癌療效有個體差異性，即不同個體對放化療的敏感性不同，考慮放射線及化療藥物敏感性與腫瘤細(xì)胞的蛋白表達(dá)、基因型有關(guān)[13-14]。DNA polβ表達(dá)是否與個體差異性，能否作為一種放化療敏感性的預(yù)測手段，目前國內(nèi)報道較少見。本研究結(jié)果顯示：1)對于DNA polβ陰性單純放療組與陰性放化療組，后者的3 a局部控制率、3 a生存率均明顯提高，提示加用化療提高了局部控制率和生存率；對比失敗原因，放化療組遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移減少，提示對于DNA polβ陰性者放療加用化療可帶來長期生存獲益，這與國內(nèi)報道食管癌放化療有益于生存相一致[15-16]；2)對于DNA polβ陽性單純放療組和陽性放化療組，2組的3 a局部控制率和3 a生存率相近，提示DNA polβ陽性者放療加用化療未見生存率提高。對比兩者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，未見明顯差異，可能與DNA polβ對化療藥物的耐藥性有關(guān)；3)將DNA polβ陰性放療組和陽性放療組比較，前者的3 a局部控制率和3 a生存率更高，提示DNA polβ陰性者的生存率較高。對比失敗原因，2組都以局部復(fù)發(fā)或未控多見，但陽性者更多，可能與DNA polβ的射線耐受有一定的相關(guān)。

總之，DNA polβ高表達(dá)影響了腫瘤細(xì)胞對射線和藥物的敏感性，可能是決定治療效果的因素之一。但尚需從分子水平進(jìn)一步了解DNA polβ在放化療前后的表達(dá)變化、耐受治療的機(jī)制等多方面問題。另外，本研究由于病灶數(shù)較少，尚需擴(kuò)大病例數(shù)及加用其他治療方法進(jìn)一步研究。

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Clinical Study of High Expression of DNA polβ and Sensitivity of Radiotherapy and Chemotherapy in the Esophageal Cancer

Ding Jiqiang,Ning Zhaofeng,Li Liang,Liu Xia,Li Ruiqing

(TaianTumorHospital,Taian271000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the relationship between expression of DNA polβ and efficacy of radiotherapy and chemotherapy for esophageal cancer.MethodsThe 98 patients with esophageal cancer were divided into four groups: the DNA polβ negative radiotherapy group,the DNA polβ negative chemoradiotherapy group,the DNA polβ positive radiotherapy group and the DNA polβ positive chemoradiotherapy group.All the patients received the common radiotherapy,2 Gy each time,5 times per week and the median prescription dose for four groups was both 60 Gy.The cisplatin,5-Fu and calcium folinate regimen was selected for the two chemoradiotherapy group.ResultsThe 3-year local control rates were 54.5%,61.5%,41.7% and 53.8% respectively in the four groups,and the 3-year survival rates were 31.8%,38.4%,25% and 26.9% respectively in the four groups.ConclusionChemoradiotherapy can improve the survival rate of patients with DNA polβ negative.

[Key words]esophageal neoplasms; radiotherapy; chemotherapy; DNA polβ; prognosis

基金項(xiàng)目：泰安市科技發(fā)展一般計(jì)劃項(xiàng)目(編號:201440774-43B)

作者簡介：丁繼強(qiáng)(1975-)，男，學(xué)士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤放療工作。E-mail：taishandjq@126.com 通信作者：李瑞卿(1964-)，男，學(xué)士，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤治療工作。E-mail：zlyylrq@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2016.03.006[中圖分類號]R735.1；R730.53

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1673-5412(2016)03-0201-05

(收稿日期：2015-01-30)