張家玲，薛良義，史鈞信

(寧波大學 海洋學院， 寧波 315211)

藍點馬鮫魚內參基因的克隆及表達穩(wěn)定性評價

張家玲，薛良義，史鈞信

(寧波大學 海洋學院， 寧波 315211)

摘 要合適內參基因的選擇是實時熒光定量PCR技術準確測定目的基因表達量的前提。首先克隆了藍點馬鮫魚3個內參基因β-actin、GAPDH和EF1-α的部分序列，并通過實時熒光定量PCR分析β-actin、GAPDH、EF1-α和18S rRNA 4個內參基因在藍點馬鮫魚各組織中的Ct值，應用3種內參基因篩選軟件(geNorm，NormFinder和Bestkeeper)綜合分析這4個基因的表達穩(wěn)定性。結果表明最穩(wěn)定的內參基因是EF1-α，其次是18S rRNA。研究結果為今后藍點馬鮫魚合適內參基因的選擇提供了依據(jù)。

關鍵詞藍點馬鮫魚；實時熒光定量PCR；內參基因；geNorm軟件；表達穩(wěn)定性

實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)技術比傳統(tǒng)的半定量及Northern雜交等方法具有靈敏度高、特異性強、快速準確等優(yōu)勢，可以更準確分析基因表達差異，成為基因表達水平測定的最常用的方法[1, 2]。但是，這種方法的準確性受到多種因素的影響，包括RNA的質量、cDNA反轉錄酶的活性、PCR擴增效率及合適的內參基因等[3, 4]，其中內參基因的選擇是一個至關重要的環(huán)節(jié)。內參基因在生物體不同組織、不同發(fā)育時期或不同實驗條件下具有相對穩(wěn)定的表達特性[5-7]。但是，近年的研究表明，在不同實驗體系中，內參基因的表達穩(wěn)定性是不一樣的。Olsvik等對大西洋鮭魚8種組織中6個內參基因的表達穩(wěn)定性進行分析，結果表明：在肌肉、肝臟、腮、頭腎、脾臟、胸腺中EF1AB是最穩(wěn)定的；在腦和腸中最穩(wěn)定的分別是EF1AA和β-actin。GAPDH在肝臟、頭腎、脾臟、腦和胸腺中穩(wěn)定性最差。建議EF1AA和EF1AB可作為大西洋鮭魚基因表達定量研究的內參基因[8]。Ma等在許氏平鲉qPCR內參基因篩選中，發(fā)現(xiàn)8種內參基因在心、肝臟、腸、腮、肌肉、腦、腎臟、脾臟、卵巢和睪丸等組織中表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性，RPL17和EF1A是最穩(wěn)定的，GAPDH是最不穩(wěn)定的[9]。所以對于不同的實驗體系，必須進行最適合內參基因的篩選，以減少實驗的誤差。藍點馬鮫魚(Scomberomorusniphoius)隸屬于鱸形目、鲅科、馬鮫屬，是一種重要的經(jīng)濟魚類。近幾年人工養(yǎng)殖馬鮫魚已經(jīng)初步成功，但是藍點馬鮫魚基因功能方面的研究非常少，NCBI數(shù)據(jù)庫只報道了18SrRNA序列，Zhang等在運用分子生物學方法識別中國南海魚類時，藍點馬鮫魚18SrRNA序列被用于DNA條形碼技術中的一種工具[10]。

本實驗選取qPCR最常使用的β-actin，GAPDH，EF1-α和18SrRNA這4 個內參基因作為篩選藍點馬鮫魚qPCR最佳內參基因的候選基因。利用geNorm軟件[11]、NormFinder軟件[12]和BestKeeper軟件[13]分析這4個候選內參基因在各組織中表達的穩(wěn)定性，篩選出最合適的內參基因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藍點馬鮫魚全部捕自浙江象山港，平均體重(0.6±0.15)kg。

1.2 方法

1.2.1總RNA提取及cDNA第一鏈合成

藍點馬鮫魚活體解剖后取樣(每組樣品分別取自3條魚)，取腦、眼、腮、腎、脾、肝臟、腸、性腺、胃、心和肌肉等11個組織，每個組織約100 mg于1.5 mL RNasefree管中，加入1 mL Trizol(Invitrogen，USA)試劑，參照Trizol說明書抽提RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA的完整性，超微量紫外分光光度計測定RNA濃度及純度。每份組織取2 μg RNA，按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，大連寶生物)說明書反轉錄合成cDNA第一鏈。得到的cDNA 樣本-20 ℃保存。

1.2.2基因組DNA的提取

采用SQ Tissue DNA Kit(Omega，USA)從肌肉組織提取藍點馬鮫魚基因組DNA。具體步驟參照說明書。

1.2.3藍點馬鮫魚內參基因的克隆

采用同源克隆的方法克隆β-actin、GAPDH和EF1-α這3個內參基因。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，搜索已登錄的鱸形目的大黃魚(Larimichthyscrocea，GenBank number：GU584189.1)；重牙鯛(Diplodussargus，GenBank：JN210581.1)；點帶石斑魚(Epinepheluscoioiaes，GenBank: AY510710.2)等的β-actin基因序列，利用Primer5.0和DNAstar軟件，設計擴增保守區(qū)的兼并引物，命名為β-actin-f和β-actin-r。

EF1-α和GAPDH的克隆步驟參照上述β-actin。引物EF-f/EF-r克隆EF1-α；GAPDH-f/GAPDH-r克隆GAPDH。分別以藍點馬鮫魚肌肉組織DNA和cDNA為模版進行PCR擴增，程序如下：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共32個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收，連接到pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆送上海華大生物技術有限公司測序。測序結果用DNAstar和blast等軟件進行分析比較。

1.3 定量引物的設計

在β-actin、GAPDH和EF1-α內部設計1對跨內含子的特異性引物作為定量引物，分別命名：β-ref-f/β-ref-r；GAPDH-ref-f/GAPDH-ref-r和EF-ref-f /EF-ref-r。根據(jù)GenBank上已報道的藍點馬鮫魚18SrRNA(Scomberomorusniphonius，GenBank number：JN211933.1)序列設計特異性的定量引物：18S-ref-f和18S-ref -r。引物相關信息見表1。

表1 實驗引物

1.4 qPCR分析

采用Fast Start Universal SYBR Green Master (Rox)(羅氏，上海)和Eppendorf Mastercycler ep Realplex2PCR儀(Eppendorf，德國)進行qPCR實驗。具體步驟參照說明書。在延伸階段檢測熒光強度，收集信號。之后進行55℃～95℃熔解曲線分析。每個樣品設3 個重復。

2 結果

2.1 藍點馬鮫魚β-actin、GAPDH和EF1-α的克隆與鑒定

引物β-actin-f/β-actin-r分別以藍點馬鮫魚肌肉cDNA和DNA為模板，克隆得到藍點馬鮫魚β-actin的cDNA序列1 128 bp，DNA序列2 114 bp(圖1)。cDNA和DNA的序列比對顯示藍點馬鮫魚β-actin含有5個外顯子和4個內含子，外顯子和內含子的邊界符合GT-AG規(guī)律。其中第1個內含子長度363 bp，第2個內含子長度415 bp，第3個內含子長度112 bp，第4個內含子長度96 bp。序列處理在線工具包(SMS)分析發(fā)現(xiàn)其cDNA編碼375個氨基酸，預測其蛋白質分子質量為41.733 ku，理論等電點(pI)為5.28。序列已提交GeneBank(GeneBank number：KT009015)。

引物GAPDH-f/GAPDH-r和EF-f/EF-r以藍點馬鮫魚肌肉DNA為模板，克隆得到藍點馬鮫魚GAPDH和EF1-α部分DNA序列，片段大小分別為：272 bp和383 bp(圖1)，GAPDH和EF1-α序列已提交GeneBank(GeneBank number：KT009013；KT009014)。

圖1 β-actin、GAPDH和EF1-α PCR產(chǎn)物

M：2000 bp Marker；1、2：GAPDH和EF1-α的DNA片段；A：2000 bp Marker；B、C：β-actin的DNA片段

2.2 內參基因定量引物的檢測

qPCR預試驗檢測引物特異性(圖2)。從熔解曲線中可以看出，引物擴增片段的特異性很好，并且無引物二聚體。

圖2 4對引物的溶解曲線

2.3 不同組織中各內參基因的Ct值

4個內參基因在各組織中的Ct值對比顯示如圖3。總體來說，18SrRNA在11種組織中的表達量最高(CtMean=13.04±0.105)；腦、眼、腮、腎、性腺、心和胃組織中EF1-α次之(CtMean=20.52±0.09)，脾和肝中β-actin次之，肌肉和腸中GAPDH次之；GAPDH在腦、眼、脾、肝、性腺、腮和腎臟中的表達量最低(CtMean=25.27±0.15)，但是在心、肌肉、胃和腸中β-actin的表達量是最低的。

圖3 4個內參基因在藍點馬鮫魚11種不同組織中

1：心；2：肌肉；3：腦；4：眼；5：脾臟；6：胃；7：肝臟；8：性腺；9：腮；10：腎臟；11：腸

2.4 內參基因的穩(wěn)定性

運用geNorm軟件對4個內參基因穩(wěn)定值進行計算，內參基因β-actin、18SrRNA、GAPDH和EF1-α的穩(wěn)定值M依次為：0.440、0.406、0.630及0.393，基因穩(wěn)定性排序為EF1-α>18SrRNA>β-actin>GAPDH。

經(jīng)過NormFinder程序計算，本試驗中藍點馬鮫魚候選內參基因穩(wěn)定性排序：EF1-α>β-actin>18SrRNA>GAPDH(表2)。

表 2 NormFinder 軟件計算出的內參基因穩(wěn)定值

BestKeeper程序根據(jù)所有被研究的基因的Ct值計算基因表達變化量。從表3中可以看出，EF1-α基因有最高的相關系數(shù)(r=0.84)，它自身的變異系數(shù)(CV)最低；標準偏差(SD)較低。所以BestKeeper分析結果與GeNorm軟件基本一致，基因穩(wěn)定性排序為：EF1-α>18SrRNA>β-actin>GAPDH。所以，綜合這3種軟件分析得出：最適內參基因為EF1-α，其次為18SrRNA。

表3 BestKeeper分析4個內參基因在藍點馬鮫魚不同組織中的表達穩(wěn)定性

3 討論

本試驗首先從藍點馬鮫魚中克隆了β-actin、GAPDH和EF1-α這3個常用內參基因，其核苷酸序列分別為2 114 bp、272 bp和383 bp。blast比對發(fā)現(xiàn)與鱸形目的條石鯛、尖吻鱸和南方黑鮪的β-Actin、GAPDH和EF1-α核苷酸序列的相似性分別為98%、99%和96%，物種間高度保守。這些基因片段補充了NCBI上藍點馬鮫魚基因數(shù)據(jù)，為今后研究藍點馬鮫魚基因表達奠定了基礎。

熒光定量PCR技術中，Ct值是指每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。比較藍點馬鮫魚各組織中4個內參基因的Ct值發(fā)現(xiàn)，18SrRNA的Ct值最低，表明藍點馬鮫魚中18SrRNA表達量最高，其次是EF1-α。

在qPCR分析過程中，評價作為校準和標準化的內參基因有多種分析方法。目前，已開發(fā)的用于內參基因篩選的軟件包括：GeNorm軟件、NormFinder軟件和BestKeeper軟件。分別使用這三個軟件對數(shù)據(jù)進行分析，選出穩(wěn)定度最高的內參基因，最后綜合這三個軟件得到最穩(wěn)定的內參基因[14]。geNorm軟件將某一看家基因與其他看家基因表達水平的兩兩比值經(jīng)對數(shù)變換后，計算其平均標準差作為基因表達穩(wěn)定度的平均值M，M值越小，說明候選內參基因的表達穩(wěn)定性越好，反之穩(wěn)定性越差[15]。geNorm用于qPCR內參基因穩(wěn)定性以及最適數(shù)目的判定，已經(jīng)在動物、微生物和植物等物種的基因表達研究中得到廣泛應用[16]。Eileen等通過geNorm軟件分析蠑螈各組織中11 個內參基因的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)ACTB是最穩(wěn)定的內參基因[17]。BestKeeper數(shù)據(jù)的初步分析是根據(jù)原始Ct值計算所有樣本中的所有內參基因的標準偏差SD(±Ct)和變異系數(shù)CV (%CT)，SD值和CV值越小，穩(wěn)定性越好。NormFinder 程序則是通過對熒光定量數(shù)據(jù)分析得出基因的表達穩(wěn)定值，根據(jù)穩(wěn)定值的大小排序，具有最小穩(wěn)定值的基因是最為穩(wěn)定的基因。Deloffre綜合GeNorm、NormFinder和BestKeeper這3 種軟件分析硬骨魚類卵子發(fā)生過程中定量內參基因表達穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)盡管這3種軟件對6個內參基因(β-actin、CTSD、CTSZ、EF1A、TBP和TUBA1A)的穩(wěn)定性排序不同，但是都選擇相同最佳內參基因CTSD和ACTB[18]。因此比較不同算法，對內參基因選擇可以提供更精確地評估。

本實驗通過這3種軟件分析候選內參基因在藍點馬鮫魚不同組織中的表達穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)EF-1α在各組織中表達最穩(wěn)定，18SrRNA次之。GAPDH是最不穩(wěn)定的，證實了這個基因作為內參基因的普遍懷疑論[19]。EF-1α和18SrRNA都可以作為藍點馬鮫魚qPCR的內參基因。但是，一般我們不選擇18SrRNA，主要是因為rRNA占總RNA量的80%左右，呈高豐度表達，可能會比目的基因的表達豐度高很多，容易造成試驗過程中和數(shù)據(jù)分析時易放大誤差。且有研究表明18SrRNA的轉錄易受到各種生物因素和藥物的影響，Spanakis等發(fā)現(xiàn)28SrRNA、18SrRNA在有絲分裂期間表達量會發(fā)生變化[20]。因此建議在藍點馬鮫魚qPCR實驗時選取EF1-α基因作為內參基因，而不是18SrRNA。本研究為今后藍點馬鮫魚基因定量表達研究中合適內參基因的選擇提供了依據(jù)。

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Cloning and expression stability evaluation of reference genes in Spanish Mackerel (Scomberomorus niphonius)

ZHANG Jia-ling, XUE Liang-yi, SHI Jun-xing

(School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

AbstractSelection of a suitable reference gene is an important prerequisite for precise analysis of target gene expression by Real-time quantitative PCR(qPCR). In this paper, the partial sequence of three reference genes, β-actin and GAPDH, EF1-α, from spanish mackerel Scomberomorus niphonius were firstly cloned, and then the Ct values of the four reference genes in various tissues were measured by qPCR. Three different statistical algorithms including geNorm, NormFinder and BestKeeper were used to analyze the expression stability of the four reference genes in different tissues. The result showed that the most stable reference gene was EF1-a, followed by 18S ribosomal RNA. It provides a useful basis for selecting of the appropriate reference gene in Spanish Mackerel.

Key wordsScomberomorus niphonius; qPCR; reference gene; geNorm; expression stability

收稿日期：2015-10-08；修回日期：2015-10-27

基金項目：寧波市科技局項目(編號：2012C10035)

作者簡介：張家玲，碩士研究生，主要從事海洋生物基因資源，E-mail：xin.jialing@163.com； 通信作者：薛良義，教授，博士生導師，主要從事魚類分子生物學研究，E-mail：xueliangyi@nbu.edu.cn。

中圖分類號Q344+.13

文獻標識碼A

文章編號2095-1736(2016)03-0020-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.020