郭　靜　向　陽(yáng)　彭友帆　韋葉生　藍(lán)　艷

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科,百色 533000)

廣西人群中IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G 多態(tài)性的分布特點(diǎn)①

郭靜向陽(yáng)②彭友帆②韋葉生②藍(lán)艷

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科,百色 533000)

[摘要]目的：研究探討IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因多態(tài)性在廣西人群中的分布特點(diǎn)。分析兩位點(diǎn)的基因型及基因頻率在不同種族間的分布差異。方法：采用單堿基延伸法(PCR-SEB)及DNA測(cè)序法對(duì)283例受試者IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其分布頻率及組間差異。結(jié)果：rs10975521A/T 存在AA、AT、TT三種基因型，分布頻率分別為12.7%、53.0%、34.3%。其各基因型及等位基因頻率在廣西人群中男女性別之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。其等位基因頻率與人類(lèi)基因組計(jì)劃公布的歐洲人(P<0.05)、北京漢族人(P<0.05)及日本人群(P<0.01)之間均有顯著差異。rs1929992A/G存在AA、AG、GG三種基因型，分布頻率分別為23.9%、53.7%、13.4%。其各基因型及等位基因頻率在廣西地區(qū)人群中男女之間也無(wú)統(tǒng)計(jì)醫(yī)學(xué)意義(P>0.05)。其基因型與歐洲人(P<0.01)、北京漢族人(P<0.05)和日本人(P<0.01)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。等位基因頻率與歐洲人(P<0.01) 、北京漢族人(P<0.05) 相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因多態(tài)性在種族和地區(qū)間存在不同程度的差異。

[關(guān)鍵詞]IL-33 ；基因多態(tài)性 ；廣西人群

白細(xì)胞介素33(Interleukin-33，IL-33)是白細(xì)胞介素1(Interleukin-1，IL-1)家族中的新成員，又稱(chēng)為IL-1F11，被Schmitz等[1]發(fā)現(xiàn)于2005年。其作用復(fù)雜，功能多面，在全身多組織器官中都有所分布。IL-33是一種多功能蛋白，一方面，它參與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，促進(jìn)肥大細(xì)胞產(chǎn)生其他至炎因子，在多種疾病及生理過(guò)程中發(fā)揮作用。另一方面，還可以在細(xì)胞核內(nèi)起到轉(zhuǎn)錄因子的作用[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-33在炎癥、微生物感染、自身免疫性疾病及心血管疾病中都有所參與[6]。近年來(lái)，隨著研究的深入與人類(lèi)基因組掃描的不斷完善， IL-33的基因多態(tài)性對(duì)疾病的影響逐漸被重視，我們?cè)谌祟?lèi)基因組掃描圖譜所公布的IL-33基因SNP位點(diǎn)數(shù)據(jù)中，篩選出次要等位基因頻率>10%的兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs10975521A/T和rs1929992A/G，并研究其在廣西人群中的分布頻率，為深入研究IL-33的基因多態(tài)性在不同種族、地區(qū)間的分布及其在疾病中的影響打下基礎(chǔ)。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象研究對(duì)象共283例，男72例，女211例。年齡19～65歲 。樣本取自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的體檢中心，篩選出日常生活功能良好，無(wú)心腦血管疾病，感染性疾病及自身性免疫性疾病，各項(xiàng)體檢指標(biāo)均無(wú)異常且相互無(wú)血緣關(guān)系的健康體檢者作為研究對(duì)象。所有研究對(duì)象均來(lái)自廣西地區(qū)，采集標(biāo)本前均已簽署知情同意書(shū)。此研究已通過(guò)本單位的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1DNA提取取靜脈血2 ml,加入EDTAN2抗凝。用(亞能生物TM全血DNA快速提取試劑盒)提取DNA，-70℃保存。

1.2.2引物的合成通過(guò)primer3在線軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)引物，由上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行合成。rs10975521A/T上游引物：TTGCATGCCAACAACAAGGAAC，下游引物：CCCCAACACCCAAATCTACACAA，延伸引物：TTTT-TTTTTTTGACAGTTCTGTAATCATATATATAGATATA-GATAA rs1929992A/G，上游引物：TCCCATGGTCATTAGTTTTGGTGA，下游引物：TTGAAGTCATCATCAACTTGGAACCT，延伸引物:TTTTTTTTTTTCCCCCCAAATTTCAA。

1.2.3PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)體系共20 μl，包含1.0 μl模板DNA,2.0 μl PCR緩沖液,2.0 μl dNTPs,1.0 U TaqDNA聚合酶,以及兩端引物各1.0 μl。剩余體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μl。使用熱啟動(dòng)Taq 酶(Qiagen 公司)進(jìn)行多重PCR 所獲得的PCR產(chǎn)物，通過(guò)蝦堿酶(SAP)(Promega公司)和外切酶I (Epicentre公司)進(jìn)行純化。延伸反應(yīng)使用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit來(lái)進(jìn)行。延伸產(chǎn)物在ABI3730XL上樣并用GeneMapper4.1分析其基因多態(tài)性。并采用測(cè)序法進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)。各位點(diǎn)基因型及等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，兩組間基因型及等位基因的頻率分布差異采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。遺傳平衡分析用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1IL-33基因位點(diǎn)rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因分型經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析，兩位點(diǎn)基因型均達(dá)Hardy-Weinberg平衡，結(jié)果具有群體代表性。rs10975521A/T與rs1929992A/G兩位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物分別為124 bp與210 bp。rs10975521A/T存在AA、AT、TT三種基因型。rs1929992A/G存在AA、AG、GG三種基因型?；驕y(cè)序證實(shí)了我們的檢驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖1、2)。

2.2兩位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在廣西人群中的分布IL-33基因rs10975521A/T 的三個(gè)基因型:AA、AT和TT在男女兩組間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs1929992A/G的三個(gè)基因型:AA、AG和GG在男女兩組間分布差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩位點(diǎn)的各等位基因頻率在男女兩組間分布差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)見(jiàn)表1。

2.3兩位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在各種族人群間分布經(jīng)分析，廣西人群rs10975521A/T各等位基因頻率與歐洲人(P<0.05)、北京漢族人(P<0.05)及日本人(P<0.01)相比，均有顯著性差異。與非洲黑人相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)尚未公布rs10975521A/T位點(diǎn)在各人群中基因型及等位基因頻率數(shù)據(jù)，四個(gè)人群的等位基因頻率數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。

圖1　IL-33基因rs10975521A/T測(cè)序圖Fig.1　Sequencing map of genotype for IL-33 genersrsrs10975521A/T polymorphismNote: Arrow of panels ①-③ showed AA，AT and TT genotypes,respectively.

圖2　IL-33基因rs1929992A/G測(cè)序圖Fig.2　Sequencing map of genotype for IL-33 gene rs1929992A/G polymorphismNote: Arrow of panels ①-③ showed AA，AG and GG genotypes,respectively.

廣西人群rs1929992A/G各基因型分布頻率與歐洲人(P<0.01)、日本人(P<0.01)、北京漢族人(P<0.05)相比具有顯著差異。與非洲黑人相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。其等位基因分布頻率與歐洲人(P<0.01)、北京漢族人(P<0.05)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與非洲黑人、日本人之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、3。

表1廣西人群IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G 基因型和等位基因頻率的比較

Tab.1Distribution of genotype and allele frequencies of IL-33 gene rs10975521A/T and rs1929992A/G in Guangxi population

RSandGendernGenotypefrequencies(%)AA(AA)AT(AG)TT(GG)Allelefrequency(%)A(A)T(G)Rs10975521Male729(12.5)38(52.8)25(34.7)56(38.9)88(61.1)Female21127(12.8)112(53.0)72(34.1)166(39.3)256(60.6)Total28336(12.7)150(53.0)97(34.3)222(39.2)344(60.8)Rs1929992Male7224(33.3)38(52.8)10(13.9)86(59.7)58(40.3)Female21169(32.7)114(54.1)28(13.2)252(59.7)170(40.3)Total28393(23.9)152(53.7)38(13.4)338(59.7)228(40.3)

Note：Genotype and allele frequencies of IL-33 gene showed no significant difference among same group of male and female(P> 0.05).

表2廣西人群rs10975521A/G基因型和等位基因分布頻率與各種族人群間的比較

Tab.2Comparison of frequency of IL-33 gene rs10975521A/G polymorphism among different ethic and regional groups

GroupsnGenotypefrequencies(%)AAATTTAllelefrequency(%)ATGuangxipeople28336(12.7)150(53.0)97(34.3)222(39.2)344(60.8)HapMap-CEU1)120---73(30.3)167(69.7)HapMap-YRI2)118---102(43.1)134(56.9)HapMap-HCB1)120---114(47.6)126(52.4)HapMap-JPT1)120---136(56.7)104(43.3)

Note：Hapmap database is still not released corresponding values，Allele frequency is derived from the NCBI databases；1)Allele frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi crowd;2)Allele frequencies,P>0.05,compared with the Guangxi crowd.

表3廣西人群rs1929992A/G基因型和等位基因分布頻率與各種族人群間的比較

Tab.3Comparison of frequency of IL-33 gene rs1929992A/G polymorphism among different ethic and regional groups

GroupsnGenotypefrequencies(%)AAAGGGAllelefrequency(%)AGGuangxipeople28393(23.9)152(53.7)38(13.4)338(59.7)228(40.3)HapMap-CEU1)12060(50.0)50(41.7)10(8.3)170(70.8)70(29.2)HapMap-YRI2)11842(35.6)56(47.5)19(16.9)140(59.3)94(40.7)HapMap-HCB1)9020(22.2)48(53.3)22(24.4)88(48.9)92(51.1)HapMap-JPT3)8834(38.6)28(31.8)26(29.5)96(54.5)80(45.5)

Note：1)Allele and genotype frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi crowd;2) Allele and genotype frequencies,bothP>0.05,compared with the Guangxi crowd；3)Genotype frequencies,P<0.01,allele,P>0.05.

3討論

IL-33位于人類(lèi)的第9號(hào)染色體上，編碼270個(gè)氨基酸。IL-33主要在人體纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、尤其是在呼吸道及消化道上皮細(xì)胞中高表達(dá)[1]。在靜止時(shí)，IL-33僅限于在細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用。而受到炎癥等刺激后，IL-33與其受體ST2結(jié)合，可刺激其下游信號(hào)分子聚集，并誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)控。IL-33還是一種“預(yù)警因子”，在細(xì)胞壞死時(shí)，IL-33可從細(xì)胞核中釋放，進(jìn)而在中性粒細(xì)胞的作用下刺激多種炎癥因子參與免疫調(diào)控[6]。IL-33在多種疾病的病理過(guò)程度有所參與，而且IL-33在機(jī)體免疫發(fā)揮作用時(shí)，具有雙面性。在寄生蟲(chóng)感染、動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖等疾病中，IL-33是一種保護(hù)因子[7，8]。而在過(guò)敏性鼻炎，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化以及膿毒血癥中又扮演著風(fēng)險(xiǎn)因子的角色[9-11]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者對(duì)IL-33產(chǎn)生了濃厚的興趣。有文獻(xiàn)報(bào)道，IL-33的血清水平在多種自身免疫性疾病中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，而IL-33的基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等也具有相關(guān)性[12,13]。

廣西地處中國(guó)西南邊界地區(qū)，共有40多個(gè)民族長(zhǎng)期共居，其地理環(huán)境獨(dú)特，與外界往來(lái)較少，生活環(huán)境相對(duì)封閉。從我們研究的結(jié)果可以看出，廣西人群IL-33基因rs10975521A/G 位點(diǎn)的等位基因頻率與歐洲人(P<0.05)、北京漢族人(P<0.05)、日本人(P<0.01)相比都存在著顯著差異。而IL-33基因rs1929992A/G位點(diǎn)的多態(tài)性雖然與非洲黑人和北京漢族人之間差異不大(P均 >0.05)，但是與歐洲人(P均<0.01)、日本人(P<0.05)相比仍表現(xiàn)出較大差異。這也體現(xiàn)了IL-33基因在種族之間所存在的差異性。

基因多態(tài)性的分布特點(diǎn)因地域不同，種族不同，環(huán)境影響和自然選擇而存在著很大差異。我們的研究結(jié)果也體現(xiàn)了這一特性?；蚨鄳B(tài)性是一種普遍存在現(xiàn)象，這種突變與人類(lèi)的進(jìn)化，環(huán)境的選擇以及病理的誘導(dǎo)都有著密切的聯(lián)系，rs10975521C/T、 rs1929992A/G位于IL-33基因的內(nèi)含子區(qū)，內(nèi)含子區(qū)的位點(diǎn)的突變有可能會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄，影響基因的表達(dá)調(diào)控和功能[14]，從而參與各種病理生理過(guò)程。隨著全基因組掃描圖譜的建立，以及在基因組關(guān)聯(lián)研究技術(shù)的幫助下，讓更多的研究者對(duì)基因多態(tài)性和疾病的關(guān)系也有了全新的認(rèn)識(shí)。我們對(duì)廣西人群IL-33基因多態(tài)性進(jìn)行研究，并分析了其在多種族人群之間的分布差異。不僅為IL-33基因多態(tài)性在人類(lèi)分布中的研究供了有用基礎(chǔ)資料，更為相關(guān)疾病的前瞻性研究打下了分子生物學(xué)層面的基礎(chǔ)。

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[收稿2016-01-12修回2016-02-16]

(編輯許四平)

Distribution characteristics of rs10975521A/T and rs1929992A/G polymorphism of IL-33 gene in Guangxi population

GUO Jing, XIANG Yang,PENG You-Fan,WEI Ye-Sheng,LAN Yan.

Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China

[Abstract]Objective:To study and explore the distribution characteristics of rs10975521A/T and rs1929992A/G polymorphism of the IL-33 gene in Chinese Guangxi population.To compare the frequency distribution differences of allele and genotype of two sites among different ethnic.Methods: The polymorphism of rs10975521A/T and rs1929992A/G of IL-33 gene in 283 subjects were analyzed with the methods of Single base extension (PCR-SEB) and DNA sequencing,and the distribution frequency and the differences between groups of that were analyzed statisticaly.Results: Three genotypes of AA，AT and TT were found in rs10975521A/T with the frequency distribution of 12.7%,53.0% and 34.3% respectively and there was no significant difference between sexes of each genotype and allele frequency in the Guangxi population (P>0.05).There were significant differences of the allele frequency of rs10975521A/T in the Guangxi population compared with that in the European (P< 0.05), han Chinese in Bejing (P< 0.05) and Japanese people (P< 0.01).Three genotypes of AA,AG and GG were found in rs1929992A/G with the frequency distribution of 23.9%,53.7% and 13.4% respectively and there was no significant difference between sexes of each genotype and allele frequency in the Guangxi population(P> 0.05),but the differences of genotype frequency of rs1929992A/G was statistically significant compared with that in the European,han Chinese in Bejing and Japanese people (P< 0.05). There were significant differences of the allele frequency between Guangxi population and European (P< 0.01),han Chinese in Bejing(P< 0.05).Conclusion: There are different degrees of discrepancy of rs10975521A/T and rs1929992A/G polymorphism of IL-33 gene among different race and region.

[Key words]IL-33;Gene polymorphism;Guangxi population

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.017

作者簡(jiǎn)介：郭靜(1987年-),女,在讀碩士，主要從事系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫機(jī)制的研究，E-mail：gjnsdy-1987@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：藍(lán)艷(1973年-),女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫機(jī)制的研究，E-mail：yylanyan@163.com。

中圖分類(lèi)號(hào)Q347

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)06-0849-04

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(81260234；81560552)、廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(YCSZ2015223)和右江民族醫(yī)學(xué)院校級(jí)課題(yy2015zd001)。

②右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，百色533000。