李進安　王永多　王　奎　賈道勇

(重慶三峽中心醫(yī)院肛腸科，重慶404000)

四君子湯含藥腦脊液對潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜淋巴細胞功能的影響①

李進安王永多王奎賈道勇

(重慶三峽中心醫(yī)院肛腸科，重慶404000)

[摘要]目的：探討四君子湯含藥腦脊液對體外培養(yǎng)的潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜淋巴細胞功能的影響。方法：制備大鼠四君子湯和美沙拉嗪含藥腦脊液，收集并分離12例健康體檢者(作為正常對照組)和18例潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜固有層淋巴細胞，分為5組：病理組、IL-12誘導組、空白腦脊液組、含藥腦脊液組、美沙拉嗪腦脊液組；通過不同處理方式體外作用細胞后，采用CCK-8檢測各組細胞增殖能力；流式細胞術(shù)檢測其周期分布及CD4+T細胞比例；ELISA檢測細胞分泌IL-1、IL-6、TNF-ɑ細胞因子的能力；Western blot檢測細胞內(nèi)IL-2蛋白的表達。結(jié)果：與IL-12誘導組和空白腦脊液組比較，含藥腦脊液組細胞增殖能力下降，細胞周期阻滯在G0/G1期，CD4+T細胞比例明顯減少，IL-1、IL-6、TNF-ɑ細胞因子分泌能力明顯下降，IL-2蛋白表達水平顯著下調(diào)。結(jié)論：四君子湯含藥腦脊液在體外能降低潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜淋巴細胞的功能，其機制可能與四君子湯調(diào)控其分泌IL-1、IL-6、TNF-ɑ等細胞因子相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]四君子湯；含藥腦脊液；潰瘍性結(jié)腸炎；機制

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種病因尚不十分清楚的直腸和結(jié)腸慢性非特異性炎癥性疾病。目前研究認為潰瘍性結(jié)腸炎并非單一因素所致，而是由遺傳、環(huán)境、微生物及腸道共生菌和黏膜免疫/炎癥系統(tǒng)等因素共同作用,最終使腸道黏膜組織免疫平衡被打破，腸道免疫反應亢進引起黏膜損傷[1]。現(xiàn)代醫(yī)學研究證明許多傳統(tǒng)中醫(yī)方劑具有免疫調(diào)節(jié)作用，其中四君子湯就是通過該機制發(fā)揮藥效作用的方劑之一，且研究證實其對多種自身免疫性疾病表現(xiàn)較好的功效[2-7]，然而四君子湯對UC免疫調(diào)節(jié)作用及其機制的研究,目前尚未見報道。本研究通過制備四君子湯含藥腦脊液,進一步探討其對UC黏膜內(nèi)免疫細胞功能的作用及其機制，為針對調(diào)節(jié)UC免疫功能，且低毒高效的天然藥物的開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗藥物人參(批號130801，吉林)，白術(shù)(批號131001，四川)，茯苓(批號130601，云南),甘草(批號130901，內(nèi)蒙古)，由我院鐘良才副主任藥師鑒定。準確稱量各藥物：人參10 g，白術(shù)10 g，茯苓10 g,甘草5 g,按照藥典的方法濃縮成相當于生藥的0.4 g/ml。美沙拉嗪腸溶片購置于葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司，研碎后溶于生理鹽水。

1.1.2動物雌性SD大鼠30只，體重180～200 g，重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供[合格證號SCXK(渝2007-0001)]。

1.1.3試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(碧云天公司)；FITC標記的Anti-CD4(美國eBioscience公司)；ELISA試劑盒(武漢博士德公司)；Anti-IL-2一抗，羊抗兔二抗(Bioss公司)。

1.2方法

1.2.1 四君子湯及美沙拉嗪含藥腦脊液的制備將大鼠隨機分為3組，每組10只。四君子湯含藥腦脊液組大鼠每日給予相當于生藥量4 mg/(kg·d)灌胃，美沙拉嗪150 mg/(kg·d)給予灌胃，空白組給予生理鹽水灌胃，三組給藥體積相同，共2周。后參照文獻[8]提取各組大鼠腦脊液。

1.2.2樣本收集及腸黏膜淋巴細胞的分離及分組本科2012年1月～2013年6月經(jīng)腸鏡及病理診斷的潰瘍性結(jié)腸炎患者18例,均符合診斷標準[9]，且均為初診病人，未經(jīng)任何相關(guān)治療，男女各半，年齡28～45歲，平均(35.5±6.4)歲。健康體檢者12例，男女各半，年齡30～41歲，平均(34.8±5.2)歲。兩組人群年齡無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

參照文獻[10]收集并分離腸黏膜淋巴細胞。將分離收集的細胞分為8組；正常對照組(C)：獲取的健康體檢者腸黏膜淋巴細胞；病理組(P)：獲取的UC患者腸黏膜淋巴細胞；IL-12誘導組(S )：在P組基礎上加入終濃度為1 mg/L IL-12；含藥腦脊液組(低，L)：在S組基礎上加入5%(體積，余下同)的四君子湯含藥腦脊液；含藥腦脊液組(中，M)：與10%的四君子湯含藥腦脊液共培養(yǎng)(余同L組)；含藥腦脊液組(高，H)：在S組基礎上加入15%的四君子湯含藥腦脊液；美沙拉嗪腦脊液組(ME)：在S組基礎上加入10%的美沙拉嗪含藥腦脊液；空白腦脊液組(CSF)：與10%的正常大鼠腦脊液共培養(yǎng)(余同L組),各組用培養(yǎng)基補至等量培養(yǎng)體系[11]。

1.2.3CCK-8實驗檢測淋巴細胞增殖能力收集分選的淋巴細胞，按5×103細胞 /100 μl /孔接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)1 h。按照分組方案，各組加入不同的藥物處理,用培養(yǎng)基補至200 μl總體系。每組設置5個復孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后各孔加入10 μl CCK-8培養(yǎng)4 h，酶標儀檢測OD450 的吸光度值，評價細胞增殖能力。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞周期分布及CD4+T細胞比例收集分離的淋巴細胞，并調(diào)整細胞數(shù)為1×107ml-1，按1×106細胞/2 ml/孔接種于12孔板中，每組均設置3個復孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，按照分組方案，各組加入不同的藥物處理48 h后2 000 r/min×5 min離心，獲取細胞。收集培養(yǎng)上清液于EP管中，用于以下細胞因子濃度的檢測。將經(jīng)上述方法獲取的各組淋巴細胞用PBS洗滌2次。一部分用-20 ℃的70%乙醇4℃固定過夜，與RNase A在37℃下共培養(yǎng)30 min后用PI染色30 min，流式細胞儀檢測分析細胞周期。另一部分細胞用FITC標記的小鼠抗人CD4抗體(1∶100)于4℃孵育30 min后經(jīng)流式細胞儀檢測CD4+T細胞比例。

1.2.5ELISA檢測淋巴細胞分泌細胞因子能力按試劑盒說明書檢測，設置酶標儀吸光度為450 nm，測定其OD值，使用Curve Exert 1.3軟件計算各組淋巴細胞分泌的因子值。

1.2.6Western blot檢測淋巴細胞IL-2的表達提取各組淋巴細胞總蛋白，調(diào)整蛋白濃度40 μg/泳道，SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗IL-2(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶3 000) 4℃孵育過夜，洗膜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜，ECL發(fā)光系統(tǒng)顯色。用FluorSTMMultimager 圖像分析儀，Quality-One4.11軟件進行圖像灰度掃描處理。

2結(jié)果

2.1四君子湯含藥腦脊液對淋巴細胞增殖的影響如圖1所示結(jié)果表明，細胞培養(yǎng)48 h后，與IL-12誘導組和空白腦脊液組比較，含藥腦脊液組(低，高)淋巴細胞無明顯的增殖抑制作用，含藥腦脊液組(中)淋巴細胞呈現(xiàn)明顯的增殖抑制，與美沙拉嗪腦脊液組比較，其增殖抑制無統(tǒng)計學意義，表明該濃度含藥腦脊液對淋巴細胞的抑制作用接近美沙拉嗪。因此，以下試驗均選取此濃度(10%體系的含藥腦脊液)作為藥物實驗的標準。

2.2四君子湯含藥腦脊液對淋巴細胞周期分布的影響正常對照組和病理組多數(shù)細胞處于G0/G1期，這符合淋巴細胞處于終末分化細胞的特性，空白腦脊液組和IL-12誘導組多數(shù)細胞處于S期，說明IL-12可以激活炎性細胞并促進其增殖的功能。與空白腦脊液組和IL-12誘導組相比，含藥腦脊液組細胞G0/G1期細胞分布比例明顯增加，與美沙拉嗪腦脊液組比較降低不明顯(圖2)。

圖1　四君子湯含藥腦脊液對淋巴細胞增殖的影響%，n=5)Fig.1　Effects of rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi decotion on proliferation of lymphocytes in %，n=5)Note: vs C and P，*.P<0.05；vs S and CSF，#.P<0.05.

圖2　四君子湯含藥腦脊液對淋巴細胞周期分布的影響%，n=5)Fig.2　Effect of rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi decotion on cell cycle of ±s，%，n=5)Note: vs C and P，*.P<0.05；vs S and CSF，#.P<0.05.

2.3四君子湯含藥腦脊液對CD4+T細胞比例的影響如圖3所示結(jié)果表明，與正常對照組比較，病理組、IL-12誘導組及空白腦脊液組CD4+T比例顯著增高。含藥腦脊液作用48 h后其比例明顯降低，與美沙拉嗪腦脊液組比較兩者無統(tǒng)計學意義。

2.4四君子湯含藥腦脊液對淋巴細胞分泌致炎因子能力的影響與正常對照組、病理組比較，IL-12誘導組及空白腦脊液組分泌IL-1、IL-6、TNF-ɑ水平明顯增高。含藥腦脊液作用48 h后其比例明顯降低，與美沙拉嗪腦脊液組比較兩者無統(tǒng)計學差異(圖4)。

2.5四君子湯含藥腦脊液對淋巴細胞IL-2表達的影響與IL-12誘導組及空白腦脊液組比較，含藥腦脊液組淋巴細胞IL-2表達水平降低，將蛋白與對應的內(nèi)參灰度的比值進行分析，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5)。

圖3　四君子湯含藥腦脊液對CD4+T細胞比例的影響±s，%，n=5)Fig.3　Effect of rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi decotion on ratio of ±s，%，n=5)Note: vs C and P，*.P<0.05；vs S and CSF，#.P<0.05.

圖4　四君子湯含藥腦脊液對淋巴細胞分泌細胞因子能力的影響Fig.4　Effect of rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi decotion on cytokine-producing of lymphocytesNote: vs C and P，*.P<0.05；vs S and CSF，#.P<0.05.

圖5　四君子湯含藥腦脊液對淋巴細胞IL-2表達影響%，n=5)Fig.5　Effect of rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi decotion on expression of IL-2 of %，n=5)

3討論

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)又稱非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種迄今病因不明但與自身免疫相關(guān)的炎癥性腸病，有慢性反復發(fā)作等特點，被WHO列為難治病之一[12]。目前治療該疾病主要是5-氨基水楊酸類藥物等，但這類藥物都存在不同的毒副作用，如胃痛、頭痛、關(guān)節(jié)痛等，甚至是白細胞減少及粒細胞缺乏等較嚴重的不良反應，發(fā)生率較高約為15%～20%，因此其臨床應用受限制[13]。中醫(yī)藥學是中華民族幾千年來防病治病經(jīng)驗的結(jié)晶，是具有中國特色的生命科學，現(xiàn)代醫(yī)學研究證明許多中醫(yī)方劑具有免疫調(diào)節(jié)作用。因此祖國傳統(tǒng)醫(yī)學為尋找既能調(diào)節(jié)UC免疫功能，又低毒高效的天然藥物提供了可能。

傳統(tǒng)醫(yī)學中并沒有與UC完全對應的病名，根據(jù)臨床特征，類似于“痢疾”、“下痢”等疾病，且認為其發(fā)病機制為“脾氣受損”，而四君子湯是“益氣健脾”的經(jīng)典方劑。初步研究證實此方治療IBD總有效率達80%以上。

IL-12在炎癥性腸病的發(fā)病中起重要作用，可以激活患者腸黏膜固有層淋巴細胞,并產(chǎn)生大量促炎癥介質(zhì)[14]。 本研究在成功分離人腸黏膜組織內(nèi)淋巴細胞的基礎上，使用IL-12激活淋巴細胞后用不同的處理方式體外作用細胞。結(jié)果證明，四君子湯含藥腦脊液對IL-12刺激的UC患者腸淋巴細胞的增殖有顯著的抑制作用，并且其作用后使細胞阻滯于G0/G1期。CD4+T細胞在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用，IL-12可以激活腸道內(nèi)的CD4+T，導致Th1樣的慢性結(jié)腸炎[15]，本研究發(fā)現(xiàn)IL-12刺激的UC患者腸淋巴細胞經(jīng)四君子湯含藥腦脊液作用48 h后，其CD4+T細胞比例明顯降低。研究證實，四君子湯含藥腦脊液不僅可抑制UC患者腸淋巴細胞的增殖，還能降低CD4+T細胞比例。

IL-1和TNF-α是IBD發(fā)病中重要的細胞因子，IL-1和TNF-α通過上調(diào)血管內(nèi)皮細胞和白細胞黏附分子的表達，促進炎癥細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附作用，有助于白細胞的炎性滲出。IL-1和TNF-α等可增強單核-吞噬細胞、中性粒細胞的吞噬殺傷功能，促進其分泌炎癥介質(zhì)。IL-1和TNF-α還可刺激血管內(nèi)皮細胞釋放一系列炎性介質(zhì)。IL-1與其受體結(jié)合后，通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)啟動包括IL-6、TNF-ɑ等在內(nèi)的多種因子的表達、釋放。研究報道UC患者腸黏膜固有層單個核細胞表達IL-1、IL-6、TNF-ɑ水平明顯升高，且升高程度與疾病嚴重程度、累及范圍以及復發(fā)密切相關(guān)[16]；其分泌的TNF-α可進一步損傷結(jié)腸組織，使腸道炎癥反應放大，引起瀑布式反應，而抑制TNF-α的合成、分泌可以有效地減輕腸道炎癥。TNF-α被認為是UC炎癥的關(guān)鍵分子[17]。IL-2通過促進NK細胞和T細胞的增殖，誘導NK等其他淋巴細胞產(chǎn)生TNF-α等細胞因子，促進B淋巴細胞的增殖分化。本研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯含藥腦脊液作用于UC患者腸黏膜淋巴細胞后，使IL-1、IL-6、TNF-ɑ、IL-2等表達水平降低，這提示四君子湯含藥腦脊液對UC患者腸黏膜淋巴細胞的增殖抑制作用是通過抑制其分泌細胞因子實現(xiàn)的。

綜上所述，四君子湯含藥腦脊液能有效抑制UC患者腸黏膜淋巴細胞的功能，其機制可能與其能降低淋巴細胞分泌的細胞因子相關(guān)。我們的研究結(jié)果為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提出了新的策略和途徑。

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[收稿2016-01-06修回2016-04-16]

(編輯倪鵬)

Effect of cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction on function of colon mucosa lymphocytes of ulcerative colitis in vitro

LI Jin-An,WANG Yong-Duo,WANG Kui,JIA Dao-Yong.

Chongqing Three Gorges Center Hospital，Section Anorectal,Chongqing 404000，China

[Abstract]Objective:To explore the effects of cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction on function of colon mucosa lymphocytes of ulcerative colitis in vitro.Methods: Prepared the rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction or Mesalamine.Collected colon mucosa of the 12 healthy (as normal group) and 18 ulcerative colitis,then isolated and obtained lymphocytes from these samples.The lymphocytes were divided into pathological group，IL-12 group，cerebrospinal fluid group cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction group，cerebrospinal fluid contained Mesalamine group.After exposing to various treatment,the proliferative capacity was measured by CCK-8,the cell cycle and the ratio of CD4+T was analyzed by flow cytometry(FCM),the content of IL-1，IL-6，TNF-α was detected by ELISA.The expression of IL-2 were detected by Western blot analysis.Results: Compared the cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction group with the IL-12 group or cerebrospinal fluid group,the proliferative capacity and the percentage of CD4+T was decreased,the cells significantly arrested at G0/G1 phase,the secretory capability of IL-1，IL-6，TNF-α were obviously reduced;the expression of IL-2 was also significantly down-regulated.Conclusion: The cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction could decrease the function of colon mucosa lymphocytes of ulcerative colitis,the mechanism involved in may be Sijunzi Decoction regulating the secretory capability of IL-1，IL-6 and TNF-α.

[Key words]Sijunzi Decoction;Cerebrospinal fluid contained drug;Ulcerative colitis;Mechanism

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.010

作者簡介：李進安(1978年-)，男，碩士，主治醫(yī)生，主要從事炎癥性腸病的基礎與臨床研究，E-mail:lijinan@126.com。

中圖分類號R329.2R733.7

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0815-05

·中醫(yī)中藥與免疫·

①本文為重慶市衛(wèi)生與計劃生育委員會中醫(yī)藥科技項目。