平昌昀　李呼倫　詹曉霞　孫　博

(哈爾濱醫(yī)科大學神經生物教研室,哈爾濱150081)

濾泡輔助性T細胞在實驗性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過程中的作用①

平昌昀李呼倫詹曉霞孫博

(哈爾濱醫(yī)科大學神經生物教研室,哈爾濱150081)

[摘要]目的：探討濾泡輔助性T細胞在實驗性自身免疫性腦脊髓炎中的作用機制。方法：隨機將C57BL/6小鼠分為CFA組、EAE組、anti-ICOSL組和control 組。用流式細胞術檢測不同時間點Tfh細胞的變化及T細胞的活化情況，石蠟切片染色觀察炎細胞浸潤、脫髓鞘及生發(fā)中心的改變，ELISA法檢測髓鞘蛋白特異性抗體的分泌水平。結果：anti-ICOSL治療組較EAE對照組臨床評分低(P<0.05)，炎癥浸潤減輕，無脫髓鞘病變,Tfh細胞比例降低，但活性不受影響，不能夠形成生發(fā)中心，并且髓鞘蛋白特異性抗體的分泌減少。結論：濾泡輔助性T細胞通過與B細胞的相互作用促進生發(fā)中心形成，分泌抗神經髓鞘蛋白MOG35-55特異性抗體發(fā)揮致病性作用。

[關鍵詞]濾泡輔助性T細胞；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；生發(fā)中心

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是T細胞介導的以中樞神經系統(tǒng)(Central nerve system，CNS)白質脫髓鞘病變?yōu)樘攸c的自身免疫性疾病[1-3],患者出現神經癥狀前的數周或數月，多有疲勞、體重減輕、肌肉和關節(jié)隱痛等。MS多次復發(fā)后,病人癥狀逐漸加重，出現無力、僵直、感覺障礙、視力損害和尿失禁[4]。各種非特異性免疫抑制治療不僅能夠引起副作用，如感染、腫瘤及骨髓抑制等，而且無法完全防止MS的復發(fā)[5]。因此，特異性MS的新療法仍是許多研究者努力的方向[6,7]。2000年，研究人員首次提出濾泡輔助性T細胞(T follicular helper cells，Tfh)為主要負責輔助B細胞的T細胞亞群，在刺激B細胞增殖、分化以及免疫球蛋白類別的轉換中起著十分重要的作用[8-11]，但是Tfh細胞參與自身免疫性疾病的作用機制至今仍未被徹底地闡明和解釋。隨著研究的深入，越來越多的實驗證據表明，B細胞和自身抗體通過多種途徑影響著MS的發(fā)病和病程轉歸[12-15]。而作為輔助B細胞的Tfh細胞是通過輔助B細胞還是通過自身的致病性參與多發(fā)性硬化、在多發(fā)性硬化中Tfh細胞又是如何變化等問題目前仍是空白。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encelphalomyelitis，EAE)是目前應用最廣泛的MS實驗動物模型，本研究通過EAE小鼠模型，探討Tfh在EAE中的作用機制，旨為臨床對MS的治療提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級C57BL/6小鼠，雌性，24只，6～8周齡，體重16～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，SCXK(京)2015-0001。對C57BL/6小鼠晝夜12 h 交替光照，自由食水，于室溫(20±2)℃條件下飼養(yǎng)。

1.1.2儀器和試劑本研究所用到的儀器為流式細胞計數儀(美國BD公司)，Digital Camera(日本HITACHI公司)，酶標儀(澳大利亞Bio-Rad公司)。

本研究所用到的試劑為結核菌素(H37RA，美國DIFCO LABORATORIES)，不完全弗氏佐劑(IFA，美國Sigma)，MOG35-55(西安聯美生物科技有限公司)，百日咳毒素(PT，List biological laboratories,inc.)，ELISA抗體(美國BD公司)，anti-ICOSL抗體(由北京博奧森生物技術有限公司合成)，HE染色試劑(天津市凱通化學試劑有限公司)，LFB染色試劑(杭州臨安金龍化工有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及EAE小鼠模型的建立隨機將C57BL/6小鼠分為CFA組：注射完全弗氏佐劑(CFA,250 μg結核菌素+50 μl IFA+50 μl 0.01 mol/L PBS)；EAE組；anti-ICOSL組和control 組：均注射CFA和MOG35-55，每組6只。免疫試劑配好后，用漩渦振蕩器充分振蕩成均勻乳白色液體后，于小鼠兩側腋窩皮下進行注射免疫。免疫當天和免疫后的第2天，EAE組、control組和anti-ICOSL治療組小鼠尾靜脈注射百日咳毒素(PT)，200 ng/只；EAE建模的第2、4、6天，anti-ICOSL組小鼠腹腔注射anti-ICOSL抗體，100 μg/次；control 組小鼠腹腔注射與anti-ICOSL 抗體同等劑量的生理鹽水。臨床評分標準：0分：正常；0.5分：部分尾癱；1分：尾癱；1.5分：尾癱伴蹣跚步態(tài)；2分：一側后肢癱瘓；2.5分：一側后肢癱瘓伴另一側后肢無力；3分：雙后肢癱瘓；3.5分：上行性癱瘓；4分：軀干無力或癱瘓；4.5：瀕死；5分：死亡。

1.2.2T淋巴細胞的提取眼球取血處死發(fā)病早期、高峰期、緩解期EAE模型小鼠，無菌取小鼠腋窩、腹股溝、腹主動脈旁淋巴結細胞和脾單核細胞。將淋巴結和脾單核細胞混合，以5×106個/ml細胞的濃度加入1640完全培養(yǎng)液，同時加入MOG35-55至終濃度為25 μg/ml，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將經過MOG35-55肽段體外刺激所獲得的特異性增殖的淋巴細胞作為實驗T淋巴細胞。

1.2.3T淋巴細胞活性及濾泡輔助性T細胞的檢測分別采用流式細胞術檢測Th細胞(主要為CD3+、CD44+及CD4+的細胞)活性和濾泡輔助性T細胞的表達(Tfh，主要為BCL-6-PE、CXCR5-PE、ICOS-PerCP)。于EAE免疫后3、5、8、15 d時分離淋巴結和脾，研磨過濾，制成淋巴細胞懸液，加入MOG(25 μg/ml)抗原刺激細胞后，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進行體外培養(yǎng)。Tfh細胞的表面標志為CD4+ICOS+CXCR5+[16]。

1.2.4組織病理學檢測于發(fā)病高峰期(第15天)取小鼠脊髓腰骶段，制成石蠟切片，用5 μm厚度的組織切片進行HE染色[17]、8 μm厚度的組織切片進行LFB染色[17]，高倍顯微鏡觀察病理改變。取發(fā)病高峰期(第15天)小鼠脾臟，制作冰凍切片，用6 μm 厚度的組織切片進行免疫組織化學染色[18]，高倍顯微鏡觀察脾組織中生發(fā)中心的形成。

1.2.5血清IgG抗體分泌水平的檢測采用酶聯免疫吸附反應(ELISA)法[19]。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS11.5軟件對相關數據進行統(tǒng)計學處理，實驗中任意兩獨立樣本之間的比較用t檢驗，多個樣本均數的比較用單因素方差分析法(One-way classification，ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1EAE小鼠模型的建立試驗結果顯示，EAE組小鼠從免疫后第10天開始出現臨床癥狀，于免疫后第15天左右達到發(fā)病高峰期，免疫后第21天開始緩解。EAE組發(fā)病小鼠的臨床評分為0.5～3.0分，第11天EAE組評分明顯高于CFA組(P<0.05)；EAE組在第11天開始出現明顯的、逐漸加重的臨床癥狀：尾部無力、蹣跚步態(tài)、單后肢至雙后肢癱瘓，嚴重者出現前肢癱瘓；第12、13、14、15天EAE組小鼠EAE評分均高于CFA組(P<0.001)。對照組在相同時間內未出現上述臨床癥狀，活動正常，見圖1。

免疫后第15天，進行HE染色，發(fā)現與CFA組相比， EAE組脊髓白質有大量的炎性細胞浸潤(單核-巨噬細胞，T淋巴細胞，B淋巴細胞，漿細胞等)， LFB染色可以觀察到EAE組脊髓有明顯的脫髓鞘病灶，病灶中髓鞘變性崩解成顆粒狀，并被吞噬細胞吞噬，形成泡沫細胞，表明小鼠EAE模型建立成功。見圖2。

2.2濾泡輔助性T細胞在淋巴結和脾中的變化情況結果表明：免疫后第5天，淋巴結中的CD4+ICOS+CXCR5+Tfh細胞增多，且Tfh數量達到高峰；EAE組和CFA組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。第8天，Tfh細胞在EAE組所占百分比明顯高于CFA組(P<0.001)；第15天，Tfh細胞在EAE組所占百分比有所下降，但仍高于對應CFA組，見圖3A。免疫后第3、5、8、15天，EAE組小鼠脾中的Tfh細胞數量均高于CFA組，且在第5天時表達最高，與CFA組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖3B。

2.3選擇性濾泡輔助性T細胞阻斷劑anti-ICOSL IgG的治療結果

圖1　EAE臨床評分及體重變化Fig.1　Clinical scores and weights of EAENote: *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖2　脊髓組織HE染色及LFB染色(×200)Fig.2　HE staining and LFB staining of spinal cord(×200)Note: A and B are EAE group:A shows HE staining,in which arrow indicates inflammatory cell infiltration；B shows LFB staining,in which arrows indicate demyelination；C and D are CFA group:C shows HE staining and D shows LFB staining.

2.3.1臨床評分和體重實驗結果表明，給予選擇性濾泡輔助性T細胞阻斷劑能夠緩解EAE疾病的進程。EAE組實驗鼠在免疫后的第10天開始發(fā)病，且隨時間延長，病情逐漸加重，約至實驗的第15天達到高峰，隨后緩解。anti-ICOSL組實驗鼠第11天開始發(fā)病，隨后以較輕的病情持續(xù)12天后緩解。EAE組實驗鼠第13～17天臨床評分與給藥組實驗鼠相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。給藥組實驗鼠在發(fā)病期間體重平均維持在約16 g；在第14～17天，EAE組實驗鼠體重下降較給藥組明顯，見圖4。

2.3.2實驗鼠脊髓脫髓鞘和淋巴細胞浸潤情況實驗結果表明，EAE組小鼠脊髓組織中可見明顯的、多發(fā)且散在的炎性細胞浸潤和脫髓鞘，anti-ICOSL治療組小鼠脊髓組織中少見明顯的炎性細胞浸潤和脫髓鞘，CFA組小鼠脊髓組織中未見有炎性細胞浸潤和脊髓脫髓鞘發(fā)生。表明濾泡輔助性T細胞選擇性抑制劑anti-ICOSL 治療可以減輕疾病，見圖5。

圖3　濾泡輔助性T細胞在C57BL/6小鼠淋巴結(A)和脾(B)中的表達Fig.3　Expression of T follicular cells on lymph nodes(A) and spleen(B)Note: *.P<0.001.

2.3.3濾泡輔助性T細胞選擇性阻斷劑anti-ICOSL對T細胞活化影響實驗結果表明，anti-ICOSL組和EAE組相比，CD44高表達的CD3+T細胞數目無差異，說明T細胞活化不受anti-ICOSL的影響；在免疫5 d后，無論是anti-ICOSL組還是EAE組淋巴結CD44高表達的CD3+T細胞數目都顯著增加(見圖6)，說明免疫5 d后淋巴結T細胞參與到免疫反應中。

2.3.4濾泡輔助性T細胞選擇性阻斷劑anti-ICOSL對ICOS高表達的CD4+CXCR5-T細胞數目影響實驗結果顯示，EAE組和anti-ICOSL組淋巴結及脾中ICOS高表達的CD4+CXCR5-T細胞數量相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖7。說明anti-ICOSL治療未抑制ICOS分子在T細胞上的表達。

圖4　anti-ICOSL 治療的臨床評分及體重變化Fig.4　Clinical scores and weight of therapy by anti-ICOSLNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

圖5　脊髓組織LFB染色(ACE)及HE(BDF)染色(×200)Fig.5　LFB staining(ACE) and HE staining(BDF) of spinal cord(×200)

2.3.5濾泡輔助性T細胞選擇性阻斷劑anti-ICOSL 對Tfh細胞數量的影響結果表明：在給予選擇性阻斷劑anti-ICOSL后，小鼠CD4+ICOS+CXCR5+Tfh細胞水平表達下降；anti-ICOSL組與EAE組相比，各時間點的小鼠淋巴結中Tfh細胞表達水平均下降；至第8天，EAE組小鼠的Tfh細胞所占百分比明顯高于anti-ICOSL組(P<0.01)，見圖8A。anti-ICOSL組小鼠脾中的Tfh細胞百分比較EAE組均有所下降，見圖8B。

2.3.6濾泡輔助性T細胞表達減少對生發(fā)中心形成的影響結果表明，至第8天，EAE組脾組織中可以看到完整的次級濾泡的形態(tài)，略呈圓形，次級濾泡中可見散在的PNA陽性細胞分布。在CFA組中未見次級濾泡形態(tài)，在anti-ICOSL組中僅可見完整的次級濾泡形態(tài)，未見PNA陽性細胞。至第15天，EAE組小鼠脾組織次級濾泡中可見成簇的PNA陽性細胞聚集，表明此時成熟的生發(fā)中心已經形成；CFA組和anti-ICOSL組中仍未見PNA陽性細胞，見圖9。

圖6　anti-ICOSL對淋巴結和脾中T細胞活化的影響Fig.6　Influence of anti-ICOSL IgG on activation of T cells in lymph nodes and spleen

圖7　anti-ICOSL對淋巴結和脾中ICOS高表達CD4+CXCR5- T細胞數目的影響Fig.7　Influence of anti-ICOSL IgG on number of CD4+CXCR5- T cells with high ICOS expression in lymph nodes and spleen

圖8　anti-ICOSL對濾泡輔助性T細胞在淋巴結(A)和脾(B)中表達的影響Fig.8　Influence of anti-ICOSL IgG on expression of Tfh cells in lymph nodes(A) and spleen(B)Note: *.P<0.01.

圖9　濾泡輔助性T細胞減少對生發(fā)中心形成的影響Fig.9　Influence of decreased Tfh cells on germinal centreNote: A，D.EAE;B,E.Anti-ICOSL group；C，F.CFA group.A，B，C.×40；D，E,F.×200；Arrows indicate PNA positive cells.

圖10　濾泡輔助性T細胞減少對髓鞘蛋白特異性抗體分泌的影響Fig.10　Influence of decreased T follicular helper cells on MOG-specific AbsNote: *.P<0.01；**.P<0.001.

2.3.7濾泡輔助性T細胞減少對髓鞘蛋白特異性抗體分泌的影響結果顯示，anti-ICOSL組各抗體分泌水平較EAE組低(IgG2a，P<0.001；IgG2b，P<0.001； IgG1，P<0.001)；anti-ICOSL組各抗體分泌水平較CFA組高(IgG2a，P<0.01； IgG1,P<0.01)。隨著TFH細胞減少，髓鞘蛋白特異性抗體分泌水平也相應降低，見圖10。

3討論

MS一直被認為是由CD4+T細胞所介導的自身免疫性疾病，在遺傳或者感染等因素的作用下，CD4+T細胞被刺激活化成中樞神經系統(tǒng)抗原特異性Th1、Th17細胞，并分泌IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-17、IL-21、IL-22等致炎性細胞因子引起一系列炎癥反應引起MS的發(fā)生[3]。此外，有實驗表明MS與B細胞也有著密切的關系。中樞神經系統(tǒng)包含多種B細胞營養(yǎng)因子，如BAFF(B-cell-activating factor of the TNF family)、APRIL(A proliferation-inducing ligand)以及漿細胞存活因子CXCL12，為B細胞發(fā)育提供了良好的微環(huán)境[20]。在多發(fā)性硬化患者的腦和腦脊液中B細胞增殖并分泌IgG[21]，同時B細胞作為專職抗原提呈細胞將抗原提呈給T細胞[22]。

濾泡輔助性T細胞(Tfh)，定位于淋巴濾泡，表型為CXCR5+CD40L+ICOS+，主要通過分泌IL-21輔助B細胞產生對T細胞依賴抗原應答[23]。Tfh已被證實了在許多免疫缺陷病和自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[16,24]。眾所周知，自身免疫紊亂主要和高親和力致病性抗體的產生息息相關。lupus疾病模型中，錯誤的Tfh細胞的擴增，可以導致自身抗體分泌增加[25]。在Roquin san/san 轉基因鼠中發(fā)現過多的Tfh細胞表達，使生發(fā)中心的反應增強，利用分離出來的Tfh細胞回輸給正常的野生型鼠，會自發(fā)性形成生發(fā)中心。在SLE模型鼠中，阻斷ICOSL-ICOS 信號通路可以通過減少Tfh細胞，從而減弱生發(fā)中心的反應，從而抑制疾病發(fā)生[26]。

Tfh細胞是輔助B細胞發(fā)揮體液免疫作用的主要效應性T細胞。這種輔助作用可以分為四個階段。①攜帶特異性抗原的樹突狀細胞將抗原提呈給初始T細胞，使之分化為效應性Tfh細胞；②效應性Tfh細胞遷移到濾泡T-B細胞邊界與抗原預激的B細胞相互接觸；③經識別共同抗原的B細胞接觸后，一部分效應性Tfh細胞遷移進入生發(fā)中心，調節(jié)抗原特異性記憶B細胞的產生；④另一部分記憶性Tfh細胞將持續(xù)存在于初始活化的微環(huán)境中調節(jié)抗原特異性記憶B細胞對再次抗原免疫的應答[27]?？乖c受體的結合程度，T-B細胞間接觸的持久性，識別共同抗原的T-B細胞上信號分子的相互作用等影響因素始終貫穿始終。Tfh細胞的形成與維持和以下信號通路有關：T細胞活化的第二信號CD28和B7(即CD80/CD86)，CD4+CD3-淋巴組織刺激細胞表達的OX40L和CD30L提供的刺激信號，T-B細胞接觸并相互作用的雙重信號刺激CD40/CD40L，ICOS/ICOSL，表面信號淋巴細胞激活分子相關蛋白(SLAM-associated protein，SAP)介導的信號通路[28]。上述作用最終都直接或間接引起B(yǎng)cl-6的表達，而Bcl-6轉錄因子，對于T細胞持續(xù)表達CXCR5，活化T細胞遷移進入淋巴濾泡以及GC的形成都具有重要作用[29]。

我們在前期工作中利用RT-PCR以及Western blot的方法檢測了Tfh細胞主要轉錄因子Bcl-6在外周淋巴器官脾和淋巴結的表達情況，結果Bcl-6在EAE發(fā)病的起始期表達有所增高。我們把檢測的時間點集中在免疫后第3、5、8、15天，利用流式細胞術檢測Tfh細胞的表面標志，結果顯示，Tfh細胞參與了EAE的疾病發(fā)生，并且在免疫后的初始期，即第5天時表達明顯增高，與CFA組相比有統(tǒng)計學意義，高峰期即免疫后15 d表達略有下降。

由于Tfh細胞在EAE中表達主要集中在發(fā)病起始期，我們提出用阻斷劑選擇性抑制Tfh細胞能否通過抑制Tfh細胞介導的體液免疫，進而緩解EAE的發(fā)病癥狀而起到治療作用這樣一個疑問。Tfh細胞的分化要求與B細胞相互作用得以維持，在這個過程中參與的關鍵信號通路是ICOS-ICOSL共刺激分子信號[30]。ICOS廣泛表達于活化的效應性T細胞上，而ICOSL是B細胞組成性表達的表面分子。因此我們在免疫早期隔日給予anti-ICOSL封閉B細胞上的ICOSL分子，試圖通過阻斷ICOS-ICOSL的信號通路，抑制Tfh細胞的表達。本實驗顯示，給予anti-ICOSL選擇性封閉性抗體后，該組小鼠的發(fā)病減輕，高峰期中樞炎性細胞浸潤減少，脫髓鞘損傷減輕。然而，整體T細胞在免疫早期及高峰期的活化程度不受影響，CD44高表達的CD3+T細胞百分比在各組間沒有差異。原因是初始T細胞主要被樹突狀細胞活化，活化后的T細胞與識別共同抗原的活化B細胞間的相互作用中，存在其他信號通路如CD80/86-CD28、CD40-CD40L等信號通路代償了被阻斷的ICOS-ICOSL信號通路的作用。因此，給予anti-ICOSL抗體后并沒有影響ICOS在活化T細胞上的表達，具有分泌致炎性細胞因子的ICOS高表達CD4+CXCR5-細胞數量也沒有減少。流式結果顯示，在發(fā)病起始期Tfh細胞在anti-ICOSL組的數量較EAE組下降，這種趨勢在淋巴結中更為明顯。由于Tfh細胞的錯誤擴增與體內高水平自身抗體密切相關[25]，那么Tfh細胞減少是否意味著自身抗體水平降低呢？我們進一步實驗發(fā)現在EAE組免疫第8天時脾中生發(fā)中心已經開始形成，第15天時可檢測到完整的生發(fā)中心，同時血清中可檢測到高水平的抗體滴度。在anti-ICOSL組免疫第15天時仍未見有明顯的生發(fā)中心形成，血清中僅可檢測到低水平的自身抗體。

本實驗結果表明Tfh細胞參與了EAE的發(fā)病過程，anti-ICOSL可以通過選擇性抑制Tfh細胞的B細胞輔助作用，抑制生發(fā)中心的形成和自身抗體的分泌，從而能夠有效緩解EAE的臨床表現。

參考文獻：

[1]Ciccarelli O,Barkhof F,Bodini B,etal.Pathogenesis of multiple sclerosis:insights from molecular and metabolic imaging[J].Lancet Neurol,2014,13(8):807-822.

[2]Hemmer B,Kerschensteiner M,Korn T.Role of the innate and adaptive immune responses in the course of multiple sclerosis[J].Lancet Neurol,2015,14(4):406-419.

[3]Dendrou CA,Fugger L,Friese MA.Immunopathology of multiple sclerosis[J].Nat Rev Immunol,2015,15(9):545-558.

[4]Steinman L.Immunology of relapse and remission in multiple sclerosis[J].Annu Rev Immunol,2014,32:257-281.

[5]Feinstein A,Freeman J,Lo AC.Treatment of progressive multiple sclerosis:what works,what does not,and what is needed[J].Lancet Neurol,2015,14(2):194-207.

[6]Levin MC,Jackson WC.Developing a therapeutic plan for treating MS:evidence for new treatments[J].J Clin Psychiatry,2014,75(12):e34.

[7]Ransohoff RM,Hafler DA,Lucchinetti CF.Multiple sclerosis-a quiet revolution[J].Nat Rev Neurol,2015,11(3):134-142.

[8]Breitfeld D,Ohl L,Kremmer E,etal.Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5,localize to B cell follicles,and support immunoglobulin production[J].J Exp Med,2000,192(11):1545-1552.

[9]Crotty S.T follicular helper cell differentiation,function,and roles in disease[J].Immunity,2014,41(4):529-542.

[10]Ise W.Development and function of follicular helper T cells[J].Biosci Biotechnol Biochem,2015,80(1):1-6.

[11]Hutloff A.Regulation of T follicular helper cells by ICOS[J].Oncotarget,2015,6(26):21785-21786.

[12]Habib J,Deng J,Lava N,etal.Blood B cell and regulatory subset content in multiple sclerosis patients[J].J Mult Scler (Foster City),2015,2(2)：1000139.

[13]Monson NL,Cravens P,Hussain R,etal.Rituximab therapy reduces organ-specific T cell responses and ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis[J].PLoS One,2011,6(2):e17103.

[14]Gupta IV,Jewell RC.Ofatumumab,the first human anti-CD20 monoclonal antibody for the treatment of B cell hematologic malignancies[J].Ann N Y Acad Sci,2012,1263:43-56.

[15]Hauser SL,Waubant E,Arnold DL,etal.B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis[J].N Engl J Med,2008,358(7):676-688.

[16]Xiao N,Eto D,Elly C,etal.The E3 ubiquitin ligase Itch is required for the differentiation of follicular helper T cells[J].Nat Immunol,2014,15(7):657-666.

[17]Tullius SG,Biefer HR,Li S,etal.NAD+ protects against EAE by regulating CD4+T-cell differentiation[J].Nat Commun,2014,5:5101.

[18]Yao Z,Yang S,He W,etal.P311 promotes renal fibrosis via TGFbeta1/Smad signaling[J].Sci Rep,2015,5:17032.

[19]Brickshawana A,Hinson SR,Romero MF,etal.Investigation of the KIR4.1 potassium channel as a putative antigen in patients with multiple sclerosis:a comparative study[J].Lancet Neurol,2014,13(8):795-806.

[20]Krumbholz M,Derfuss T,Hohlfeld R,etal.B cells and antibodies in multiple sclerosis pathogenesis and therapy[J].Nat Rev Neurol,2012,8(11):613-623.

[21]Franciotta D,Salvetti M,Lolli F,etal.B cells and multiple sclerosis[J].Lancet Neurol,2008,7(9):852-858.

[22]Townsend MJ,Monroe JG,Chan AC.B-cell targeted therapies in human autoimmune diseases:an updated perspective[J].Immunol Rev,2010,237(1):264-283.

[23]King C,Tangye SG,Mackay CR.T follicular helper (TFH) cells in normal and dysregulated immune responses[J].Annu Rev Immunol,2008,26:741-766.

[24]Linterman MA,Rigby RJ,Wong RK,etal.Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity[J].J Exp Med,2009,206(3):561-576.

[25]Sweet RA,Lee SK,Vinuesa CG.Developing connections amongst key cytokines and dysregulated ger minal centers in autoimmunity[J].Curr Opin Immunol,2012,24(6):658-664.

[26]Hu YL,Metz DP,Chung J,etal.B7RP-1 blockade ameliorates autoimmunity through regulation of follicular helper T cells[J].J Immunol,2009,182(3):1421-1428.

[27]McHeyzer-Williams LJ,Pelletier N,Mark L,etal.Follicular helper T cells as cognate regulators of B cell immunity[J].Curr Opin Immunol,2009,21(3):266-273.

[28]Nurieva RI,Chung Y.Understanding the development and function of T follicular helper cells[J].Cell Mol Immunol,2010,7(3):190-197.

[29]Hatzi K,Nance JP,Kroenke MA,etal.BCL6 orchestrates Tfh cell differentiation via multiple distinct mechanisms[J].J Exp Med,2015,212(4):539-553.

[30]Choi YS,Kageyama R,Eto D,etal.ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor Bcl6[J].Immunity,2011,34(6):932-946.

[收稿2016-02-03修回2016-04-14]

(編輯張曉舟)

Mechanism of T follicular cells in experimental autoimmune encephalomyelitis

PING Chang-Yun,LI Hu-Lun，ZHAN Xiao-Xia,SUN Bo.

Department of Neurobiology,Harbin Medical University,Harbin 150081，China

[Abstract]Objective:To evaluate the mechanism of T follicular helper cells (Tfh) in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) via in vivo experiments.Methods: C57BL/6 mice were randomly divided into four groups,CFA group，EAE group，anti-ICOSL group and control group.Lymphocytes of different time points isolated from draining lymph nodes and spleen were stained for T follicular helper cells surface marker and T cells activation surface marker and analyzed by FACS.Observed parameters include inflammatory infiltration,demyelination in spinal cord and germinal center in spleen.ELISA was used to measure the level of antigen specific antibodies.Results: Mice in anti-ICOSL treated group developed mild disease was with lower clinical scores when compared with the EAE group.HE staining results turned out with alleviated inflammation and Luxol Fast Blue staining(LFB) showed no demyelization in anti-ICOSL treated mice compared with non-treated EAE models.Flow cytometry results revealed that percentages of T follicular helper cells decreased though the whole activated degree T cells was not influenced in anti-ICOSL treated group.Fewer ger minal center was found in both anti-ICOSL group and CFA group with reduced secretion of MOG-specific Ab.Conclusion: T follicular helper cells supported the development of cognate B cells,promoted the formation of germinal center,facilitate pathogenic MOG-specific Ab secretion,thus enhance EAE.

[Key words]T follicular helper cells(Tfh);Experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE);Germinal center(GC)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.004

作者簡介：平昌昀(1990年-)，女，醫(yī)學碩士，主要參與多發(fā)性硬化及其動物模型的研究，E-mail：pingchangyunhmu@163.com。 通訊作者及指導教師：孫博(1979年)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事神經免疫學的研究，E-mail：sunbo720@aliyun.com。

中圖分類號Q189

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0787-07

①本文受國家自然科學基金(81571168；81430035)資助。