肖代敏　張志敏　呂純莉　曹　喻　易禎禛

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州　遵義　563099)

戴氏綠僵菌多糖對(duì)衰老小鼠免疫功能的影響

肖代敏張志敏1呂純莉曹喻易禎禛

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州遵義563099)

〔摘要〕目的探討戴氏綠僵菌多糖對(duì)衰老模型小鼠免疫功能的影響。方法建立D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型小鼠，同時(shí)灌胃不同劑量的戴氏綠僵菌多糖，6 w后，觀察模型小鼠體重變化，免疫器官(胸腺、脾臟)指數(shù)，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬及血清中IgG含量等免疫功能的影響。結(jié)果戴氏綠僵菌多糖能夠改善模型小鼠體重;3種不同劑量的多糖均能提高模型小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖能力，高劑量蟲草多糖能提高B淋巴細(xì)胞增殖能力;同時(shí)能夠顯著提高小鼠脾臟、胸腺指數(shù)及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力及顯著提高血清中IgG的含量。結(jié)論戴氏綠僵菌多糖可增強(qiáng)亞急性衰老模型小鼠的細(xì)胞和體液免疫功能。

〔關(guān)鍵詞〕戴氏綠僵菌;多糖 D-半乳糖;衰老;免疫功能

蟲草(Cordyceps)是一種特殊類型的藥用真菌，屬真菌門(Eulnycota)，子囊菌亞門(Aseomyeotina)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值的真菌資源。我國(guó)蟲草資源分布是世界上最多最廣的國(guó)家。研究表明，蟲草及其發(fā)酵菌絲體具有抗腫瘤、抗氧化、抗突變、降血糖、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理作用〔1～3〕，其中多糖是目前最具開發(fā)利用的活性成分之一。戴氏蟲草及其無(wú)性型-戴氏綠僵菌是由我國(guó)學(xué)者梁宗琦等在貴州省首次發(fā)現(xiàn)〔4〕。前期研究表明具有抗腫瘤、抗氧化及抗突變活性，作為新種的戴氏綠僵菌，其胞內(nèi)多糖的免疫調(diào)節(jié)活性研究還鮮見報(bào)道。衰老是由多方面因素造成的，本實(shí)驗(yàn)以小劑量連續(xù)多次注射D-半乳糖誘導(dǎo)亞急性衰老模型〔5〕，并從衰老發(fā)生的免疫學(xué)角度探討戴氏綠僵菌多糖的抗衰老的免疫學(xué)活性。

1材料與方法

1.1藥品及器材蟲草多糖由本實(shí)驗(yàn)室提取、分離，并經(jīng)紫外、紅外光譜、葡聚糖凝膠柱和GC-MS聯(lián)用儀分析鑒定〔6〕。全自動(dòng)生化分析儀(日本，Olympus，AU2700)；CO2培養(yǎng)箱、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、MTS細(xì)胞繁殖定量檢測(cè)試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司 GMS10043)；EZ-SepTMMouse 1X 淋巴細(xì)胞分離液(深圳，達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；刀豆蛋白(美國(guó)Sigma公司)，脂多糖(LPS，美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季清生物公司)；5%雞紅細(xì)胞混懸液(自制)。

1.2樣品配制D-半乳糖:0.9%NS 200 ml、D半乳糖0.96 g、配制成4.8 mg/ml溶液。多糖溶液：按400 mg·kg·d劑量，灌胃0.5 ml/只計(jì)算(高劑量)。按200 mg·kg·d劑量，灌胃0.5 ml/只計(jì)算(中劑量)。按100 mg·kg·d劑量，灌胃0.5 ml/只計(jì)算(低劑量)。3種濃度的多糖液用生理鹽水配制，1次/w，4℃保存。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠，4～6周齡，18～22 g，雄性。由第三軍醫(yī)大學(xué)大平醫(yī)院動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：scxk(渝)20070003。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動(dòng)物分組及建模將小鼠隨機(jī)分為五組：空白組、模型組、多糖高劑量組、多糖中劑量組、多糖低劑量組，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，除空白組外，其他每組每日頸部皮下注射D-半乳糖溶液120 mg·kg-1·d-1，空白組注射同劑量的生理鹽水，為期6 w，從注射第2周開始，多糖3個(gè)劑量組每日灌胃相應(yīng)劑量的多糖液進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)4 w。測(cè)定各生化指標(biāo)和計(jì)算脾臟、胸腺指數(shù)。并于開始灌胃前及灌胃后每隔3 d稱量1次各組小鼠體重。

1.4.2小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的實(shí)驗(yàn)〔7〕模型建成后，小鼠處理前30 min注射5%雞紅細(xì)胞生理鹽水懸液0.8 ml，0.5 h后，用乙醚將老鼠麻醉至昏迷，摘除眼球取血于2 ml的EP管中，備用。頸椎脫臼處死，經(jīng)腹腔注射生理鹽水2 ml，吸出腹腔洗液0.5～1 ml，滴于載玻片上，于37℃孵化箱中溫孵30 min，然后用生理鹽水漂洗、晾干，用甲醛溶液固定，瑞氏染液染色5 min，用蒸餾水漂洗、晾干，在顯微鏡下鏡檢，計(jì)數(shù)。記錄100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬了雞紅細(xì)胞的數(shù)量和吞有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)目，并按下式求出巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù):吞噬百分率(%)= 吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)× 100%。

1.4.3小鼠脾臟、胸腺的稱量方法小鼠末次給藥24 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，解剖小鼠，取其脾臟、胸腺，吸干表面血污，精密稱量，將稱量所得的質(zhì)量換算成各臟器對(duì)應(yīng)的指數(shù)，脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)重量(mg)/體重(g)。

1.4.4小鼠淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)斷頸處死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡5～10 min。在超凈臺(tái)中無(wú)菌取出小鼠脾臟。放入裝有5 ml EZ-SepTMMouse 1×淋巴細(xì)胞分離液的一次性平皿中。用鑷子固定尼龍網(wǎng)，然后用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細(xì)胞透過(guò)尼龍網(wǎng)(200目)進(jìn)入淋巴細(xì)胞分離液中。把懸有脾臟細(xì)胞的分離液立即轉(zhuǎn)移到離心管中，離心前再覆蓋上大約 200 μl的1640培養(yǎng)基。2 500 r/min離心30 min。吸出淋巴細(xì)胞層(培養(yǎng)基層下，分離液上)，用10 mlPBS洗滌2 500 r/min離心10 min。傾倒上清液，加入1 ml完全1640懸液，計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)制成1.0×107/ml的脾細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)采用96孔培養(yǎng)板，每孔加入脾細(xì)胞懸液100 μl，平行3個(gè)復(fù)孔，然后加入使得孔最終濃度為5 μlg/ml的LPS和刀豆蛋白液10 μl，同時(shí)做不加刀豆蛋白和LPS的陰性對(duì)照孔(用10 μl 1640代替)，空白對(duì)照只加完全1640，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTS，每孔10 μl(按MTS使用說(shuō)明書進(jìn)行)，在490 nm處測(cè)OD值。

1.4.5血清IgG的測(cè)定小鼠眼眶取血，離心取血清，用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血清IgG含量進(jìn)行測(cè)定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法組間比較行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1衰老模型小鼠體重變化在灌胃的前3 d，體重均有下降趨勢(shì)，尤其以高劑量組較為明顯，其原因可能是開始灌胃后，各組小鼠適應(yīng)性問(wèn)題導(dǎo)致食欲減退，體重下降。之后各組小鼠體重均逐漸增加，但模型組小鼠體重增加的程度明顯低于其他各組。體重增長(zhǎng)最快的是高劑量組。其他各組與空白組基本一致。見圖1。

圖1　衰老模型各組小鼠體重隨時(shí)間變化

2.2腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力實(shí)驗(yàn) 模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力較低，給予不同劑量的多糖后，各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分?jǐn)?shù)和吞噬指數(shù)均高于模型組，其中高劑量組與模型組比較有顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1　多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響±s)

與模型組比較：1)P<0.05，下表同

2.3衰老模型各組脾臟和胸腺指數(shù)結(jié)果高劑量組和中劑量組脾臟指數(shù)顯著高于模型組(P<0.05)。其他兩組脾臟指數(shù)也較模型組高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其可能原因是樣本例數(shù)較少或者是實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短所致。除高劑量組和的中劑量組胸腺指數(shù)與模型組比較有顯著差異外(P<0.05)，其余兩組均無(wú)顯著差異(P>0.05)，但胸腺指數(shù)均較模型組高。見表2。

表2　衰老模型各組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)比較±s)

2.4淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)3種不同劑量的多糖均能提高模型小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖能力，呈梯度增加(P<0.05,P<0.01)。而對(duì)B淋巴細(xì)胞的影響，只有高劑量組與模型組相比有顯著差異(P<0.05)，中劑量組和高劑量組無(wú)明顯影響。見表3。

2.5血清IgG含量通過(guò)測(cè)定小鼠血清中IgG的含量，各多糖劑量組小鼠的血清IgG含量與模型組相比，其值表現(xiàn)出非常明顯的差異，隨劑量的增加含量呈梯度增加(P<0.05,P<0.01)，見表3。

表3　多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體的免疫器官逐漸萎縮，免疫細(xì)胞及亞細(xì)胞因子降低，機(jī)體的免疫功能逐漸減弱，對(duì)外界病原體的抵抗能力明顯減弱〔8〕。隨著年齡的增長(zhǎng)，免疫器官老化，感染性疾病、癌癥等發(fā)病率、死亡率逐漸增高。免疫衰老與個(gè)體壽命之間的聯(lián)系也得到了證據(jù)支持〔9〕。

D-半乳糖致衰老模型是基于衰老的代謝學(xué)說(shuō)而復(fù)制的一種衰老模型，具有與自然衰老相似的自由基代謝紊亂特征，其衰老反應(yīng)接近或相當(dāng)于自然衰老。本實(shí)驗(yàn)建模成功，所測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠。機(jī)體中的免疫系統(tǒng)是由免疫器官和免疫細(xì)胞組成，免疫器官有許多，如：胸腺、脾臟、肝臟等，這些免疫器官的重量，尤其是免疫器官的重量指數(shù)可比較客觀地反映機(jī)體免疫器官的發(fā)育情況，當(dāng)機(jī)體的免疫功能增強(qiáng)時(shí)，其重量有所增加。本研究中的高劑量多糖組和中劑量多糖組的小鼠的脾臟和胸腺重量較空白組都明顯增加，故戴氏綠僵菌多糖達(dá)到一定劑量就能夠?qū)μ悄虿⌒∈蟮拿庖吖δ苓M(jìn)行提高。

本研究結(jié)果表明戴氏綠僵菌多糖能夠?qū)喖毙运ダ闲∈篌w重的保護(hù)及免疫器官的老化具有一定的緩解作用，且隨著劑量的增加而增加，并能明顯改善衰老模型小鼠T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖能力，增強(qiáng)其對(duì)外來(lái)抗原的反映性，提高模型小鼠血清中IgG含量，在一定程度上反映了機(jī)體體液免疫的調(diào)節(jié)能力。同時(shí)具有增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力，從而增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞及體液免疫功能。但它增強(qiáng)衰老機(jī)體免疫功能發(fā)生的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究探討。

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〔2014-12-31修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：貴州省科技廳基金(黔科合J字〔2009〕2148號(hào))；貴州省科技廳聯(lián)合基金(黔科合J字LKZ〔2011〕35號(hào))

通訊作者：張志敏(1979-),女，碩士，教授，主要從事分子生物學(xué)研究。

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2625-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.026

1遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室

第一作者：肖代敏(1975-),男，碩士，副教授，主要從事藥用真菌與生化藥學(xué)研究。