吳奕征　孫葉丹　陸建紅　陳國軍　董長林

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，浙江　杭州　310029)

薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細胞因子表達水平及其免疫功能的影響

吳奕征孫葉丹1陸建紅2陳國軍2董長林2

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，浙江杭州310029)

〔摘要〕目的探討薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細胞因子表達水平及其免疫功能影響。方法選擇健康雄性Wistar大鼠，采用Ⅱ型膠原蛋白及弗氏完全佐劑建立大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型，隨機分為對照組、模型組、藥物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組(分別為30.0、60.0、120.0 mg/kg薯蕷皂苷)，每組10只，第14天開始灌胃給藥，第35天處死大鼠，無菌取大鼠腹腔巨噬細胞測定其吞噬功能，測定白細胞介素(IL)-1水平，脾細胞分泌因子IL-2水平，PCR測定腹腔巨噬細胞中腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA表達水平。結(jié)果與模型組比較，薯蕷皂苷藥物組可顯著抑制關(guān)節(jié)腫脹度(P<0.05)，減輕關(guān)節(jié)病理組織損傷，呈現(xiàn)一定劑量依賴性；與模型組比較，藥物組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能下降，IL-1及脾細胞IL-2分泌水平下降，TNF-α mRNA表達水平降低(P<0.05)，呈現(xiàn)一定劑量依賴性。結(jié)論薯蕷皂苷可顯著抑制膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥程度，改善病理組織損傷，其作用機制可能與降低大鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，下調(diào)炎癥因子分泌表達水平相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕薯蕷皂苷；巨噬細胞；免疫功能；TNF-α

目前對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機制尚未完全闡明，尚無較好根治方法〔1〕。薯蕷皂苷為薯蕷科植物穿山龍薯蕷根莖提取物，具有抗血栓形成、抗腫瘤、抗感染、抗過敏、抗病毒、降低膽固醇等多種藥理作用〔2〕。近年來研究結(jié)果顯示〔3〕，薯蕷皂苷具有較強抗炎作用，可抑制膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠足趾腫脹，可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB活性，降低血管生成因子表達水平，下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨環(huán)氧化酶(COX)-2、前列腺素(PG)E2表達水平，可用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。本研究旨在探討薯蕷皂苷對腹腔巨噬細胞吞噬功能及細胞因子表達水平的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物選擇健康雄性Wistar大鼠，體重120～140 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供(許可證號：SYXK-2013-0025)，SPF級動物實驗室，飲食進水均符合實驗動物標準。

1.2試驗藥物與試劑薯蕷皂苷(單體，購自美國Sigma公司，純度95%)采用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(購于南京建成生物工程研究所)配置相應(yīng)濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配，雞Ⅱ型膠原蛋白及弗氏完全佐劑(購于美國Sigma公司)，中性紅(購于美國Sigma公司)，腫瘤壞死因子(TNF)-α逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購于Promega公司)。

1.3實驗方法

1.3.1動脈模型建立〔4〕?、蛐湍z原蛋白溶于冰乙酸(0.1 mol/L)制成2 g/L溶液，4℃攪拌過夜后等體積與弗氏完全佐劑1 g/L溶液混合乳化，制成混懸乳劑(濃度1 g/L)。分別于第0、7天大鼠背部皮內(nèi)注射1 ml混懸乳劑(每次6個點)，對照組大鼠注射等量生理鹽水。造模14 d后選取關(guān)節(jié)評分>2分的大鼠，隨機分為模型組、藥物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組(30.0、60.0、120.0 mg/kg薯蕷皂苷)，每組10只，第14天開始灌胃給藥，對照組、模型組的大鼠給予等量CMC-Na，藥物組大鼠給予相應(yīng)劑量藥物，第35天處死大鼠。

1.3.2大鼠足腫脹度測定大鼠造模第7、14、21、28、35天測定體重及左后足爪容積(足爪儀)，足腫脹度=致炎后足爪容積-致炎前足爪容積。

1.3.3病理組織學(xué)觀察取大鼠膝關(guān)節(jié)用中性甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.4大鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能測定參考文獻〔5〕方法制備大鼠腹腔巨噬細胞，調(diào)整細胞濃度為1×109/L(RPMI-1640培養(yǎng)液)，中性紅試驗測定巨噬細胞吞噬功能〔6〕，酶標儀測定吸光度A。

1.3.5脾淋巴細胞因子表達水平制備脾細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×109/L，加入3 mg/L刀豆蛋白誘導(dǎo)淋巴細胞分泌(IL)-2，采用脾淋巴細胞增殖法測定脾細胞因子IL-2水平〔7〕。

1.3.6巨噬細胞IL-1、TNF-α mRNA表達水平參考文獻方法制備大鼠腹腔巨噬細胞〔5〕，調(diào)整細胞濃度為1×109/L，采用胸腺細胞增殖法測定巨噬細胞因子IL-1水平〔8〕，PCR測定腹腔巨噬細胞中TNF-α mRNA表達水平。引物由上海生物技術(shù)公司提供，重復(fù)循環(huán)30個：94℃變性40 s，54℃ 40 s、72℃1 min。采用Eagle eye TMⅡ型圖像分析系統(tǒng)掃描，TNF-α mRNA相對表達量=TNF-α吸光度/β-actin吸光度。TNF-α引物：片段長度426 bp，上游5′-CGTCGTAGCCAAACCACCAAG-3′，下游5′-CACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′；β-actin引物：片段長度543 bp，

上游5′-GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3′，下游5′-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3′。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析和LSD檢驗。

2結(jié)果

2.1薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹的影響與對照組比較，模型組大鼠7 d后體重增長緩慢，造模后14 d出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥，藥物組大鼠足腫脹有不同程度減輕(P<0.05)，體重有不同程度增加。見圖1。

2.2薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠病理組織損傷的影響對照組大鼠滑膜組織細胞排列整齊，軟骨表面光滑；模型組大鼠滑膜組織上皮細胞纖維化，細胞炎性浸潤增生，軟骨損傷。藥物組炎性細胞浸潤不同程度減輕，增生減少。見圖2。

A～E：分別為對照組、模型組、藥物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組圖1　薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠體重、足腫脹影響

圖2　薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠病理組織損傷的影響(HE，×200)

2.3薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能及細胞因子的影響與對照組比較，模型組巨噬細胞吞噬功能升高，IL-1、IL-2水平增加，TNF-α mRNA表達上調(diào)，藥物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠吞噬吞噬功能不同程度降低(P<0.05)，IL-1、IL-2水平及TNF-α mRNA表達受到不同程度抑制，呈現(xiàn)一定劑量依賴性。見表1。

表1　薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細胞

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與藥物Ⅰ組比較：3)P<0.05；與藥物Ⅱ組比較：4)P<0.05

3討論

膠原性關(guān)節(jié)炎模型與佐劑性關(guān)節(jié)炎模型均為免疫性炎癥模型，與佐劑性關(guān)節(jié)炎模型比較，膠原性關(guān)節(jié)炎模型免疫功能變化表現(xiàn)在細胞免疫及體液免疫，與人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎更接近，為篩選抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常用有效模型〔9〕。薯蕷皂苷具有多種藥理活性，近年來研究表明薯蕷皂苷對于膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠有較強抗感染作用，可抑制小鼠耳廓腫脹及減輕小鼠扭體反應(yīng)，減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織增生及關(guān)節(jié)軟骨損傷，降低炎性細胞浸潤，可通過抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，降低血管生成因子表達水平，下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨COX-2、PGE2表達水平〔10〕。機體免疫系統(tǒng)損傷后可導(dǎo)致癌癥、感染及自身免疫疾病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎為由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥性疾病。本研究提示薯蕷皂苷可明顯治療膠原性關(guān)節(jié)炎。

免疫系統(tǒng)受到特殊抗原及自身抗體刺激時，炎癥介質(zhì)主要來源于活化的巨噬細胞，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病變過程中巨噬細胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)發(fā)揮重要作用，早期感染階段，巨噬細胞通過吞噬作用發(fā)揮非特異性免疫，活化巨噬細胞分泌促炎細胞因子〔11，12〕。關(guān)節(jié)軟骨分解代謝過程中IL-1、TNF-α具有重要作用，可通過上調(diào)誘導(dǎo)酶、細胞基質(zhì)金屬蛋白酶等表達破壞軟骨基質(zhì)，下調(diào)軟骨基因表達連接蛋白、Ⅱ型膠原等抑制合成軟骨基質(zhì)；IL-1與滑膜細胞纖維化及血管內(nèi)皮細胞增殖等因素有關(guān)，TNF-α主要促進炎癥反應(yīng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1，而IL-1可增加TNF-α活性〔11，12〕。抑制TNF-α、IL-1水平可減輕炎癥程度；IL-2可反映細胞免疫功能。本研究結(jié)果提示薯蕷皂苷抗感染與調(diào)節(jié)免疫功能與下調(diào)細胞因子TNF-α、IL-1、IL-2表達水平相關(guān)。

4參考文獻

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〔2015-07-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：陸建紅(1969-)，女，副主任技師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗及細胞形態(tài)學(xué)分析方面的研究。

〔中圖分類號〕R.593.21

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2607-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.017

1浙江省食品藥品檢驗研究院2武警浙江總隊嘉興醫(yī)院檢驗科

第一作者：吳奕征(1994-)，男，在讀本科，主要從事臨床醫(yī)學(xué)及實驗診斷研究。