李穎曦，陳丹，王小東，景亞青，李克秋，李光

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丹柴合劑對(duì)樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用

李穎曦1，陳丹2，王小東2，景亞青1，李克秋1，李光1

摘要：目的研究中藥復(fù)方制劑丹柴合劑對(duì)樹突狀細(xì)胞（DCs）的誘導(dǎo)分化作用，并探討其機(jī)制。方法制備丹柴合劑的大鼠含藥血清。分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)磁珠篩選出CD14+單核細(xì)胞，培養(yǎng)5～7 d獲得未成熟樹突狀細(xì)胞（imDCs），分為空白血清組與含藥血清組，空白血清組分別加入含或不含脂多糖（LPS）的大鼠空白血清，含藥血清組分別加入含或不含LPS的大鼠含藥血清。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表面分子CD86、CD11b和人白細(xì)胞抗原（HLA）-DR的表達(dá)；用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)DCs分泌白細(xì)胞介素（IL）-10的水平；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs對(duì)T細(xì)胞增殖能力的影響；用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）基因的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)丹柴合劑作用后，DCs高表達(dá)CD11b，低表達(dá)CD86與HLA-DR，IL-10分泌增加。且該制劑通過促進(jìn)DCs表達(dá)IDO進(jìn)而抑制DCs介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖能力。結(jié)論丹柴合劑可誘導(dǎo)DCs分化為調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞（DCregs）并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：樹突細(xì)胞；免疫耐受；吲哚胺-吡咯2,3-雙加氧酶；調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)

作者單位：1天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室（郵編300070），2藥理學(xué)教研室

一直以來，免疫排斥反應(yīng)是治療器官移植和自身免疫性疾病的瓶頸。誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)移植物抗原和自身抗原的免疫耐受是治療器官移植后免疫排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的關(guān)鍵。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）是體內(nèi)作用最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，它具有雙向調(diào)控免疫作用的功能，既可提呈抗原，激活T細(xì)胞，刺激免疫應(yīng)答，又可抑制T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)免疫耐受[1]。近年來，調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞（regulatory dendritic cells，DCregs）誘導(dǎo)的免疫耐受作用備受關(guān)注，在器官移植后免疫排斥反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療中具有潛在前景[2]。DCregs是一類具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的DCs亞群，其高表達(dá)CD11b/c分子、低表達(dá)共刺激分子CD80、CD86和人白細(xì)胞抗原（HLA）-DR，其可增強(qiáng)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β的分泌，還可抑制T細(xì)胞增殖并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增，從而誘導(dǎo)免疫耐受[3]。目前，DCregs已成為治療包括移植物抗宿主病在內(nèi)的免疫相關(guān)疾病的一種新策略[4]。中藥復(fù)方制劑丹柴合劑是天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院吳雄志教授在長期臨床工作中總結(jié)出的具有誘導(dǎo)免疫耐受作用的驗(yàn)方，本文旨在研究丹柴合劑對(duì)DCs的誘導(dǎo)分化作用和對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)，并探討其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SPF級(jí)成年SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2材料與試劑CD14+磁珠購自德國Miltenyi Biotec；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone Thermo Scientific；胎牛血清購自以色列Biological Industries；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）與IL-4購自美國R&D Systems；LPS購自美國Sigma-Aldrich；anti-CD86抗體、anti-CD11b抗體、an?ti-HLA-DR抗體、同型抗體、anti-CD4+FITC抗體和7-AAD抗體均購自美國BioLegend。人IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒購自北京達(dá)科為。Trizol購自美國Life Technologies；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen；實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR）試劑盒購自美國Applied Biosystems。引物合成于上海生工生物工程公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1丹柴合劑及含藥血清的制備采用經(jīng)常規(guī)炮制的生藥，按份數(shù)稱取柴胡6 g、牡丹皮6 g、白芍6 g、郁金6 g、甘草6 g，分別粉碎為粗末，混合，放入100℃沸水中浸泡30 min，再加入8倍的水，在100℃條件下浸提1 h，共浸提2次，最后將所得水提液合并使用；水提液經(jīng)濾紙充分過濾后3 500 r/min離心15 min；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干，得到凍干粉，藥物得率為11.5%（W/W）。取該中藥復(fù)方制劑凍干粉，用PBS稀釋成適宜濃度，以6 g/kg劑量給予大鼠灌胃，每日2次，連續(xù)給藥3 d，作為含藥血清組；將等體積的PBS給予大鼠灌胃，作為空白血清組。末次給藥后1 h經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置3 h后無菌分離血清，再經(jīng)56℃滅活30 min，即可得到含藥/空白血清，凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)從健康志愿者的外周靜脈血中梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），再經(jīng)CD14+磁珠篩選出純度可達(dá)90%的CD14+單核細(xì)胞。淋巴細(xì)胞取自第0天已貼壁的PBMC上清液。將CD14+單核細(xì)胞用含20%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸并以1×106個(gè)/mL密度接種，加入60 μg/L GM-CSF和30 μg/L IL-4，培養(yǎng)5～7 d獲得未成熟樹突狀細(xì)胞（immature dendritic cells，imDCs）。收集imDC，

分為空白血清對(duì)照組與含丹柴合劑的含藥血清組?？瞻籽鍖?duì)照組分別加入含或者不含LPS（100 μg/L）的10%體積的大鼠空白血清，而含藥血清組分別加入含或者不含LPS（100 μg/L）的10%體積的含藥血清。

1.2.3 DCs表型分子鑒定收集imDC，實(shí)驗(yàn)方法與分組同1.2.2。48 h后收集細(xì)胞，用100 μL PBS緩沖液重懸，加入異硫氰酸熒光素（FITC）或棗紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗體（anti-CD86、anti-CD11b、anti-HLA-DR），于4℃避光孵育20～30 min，PBS洗2遍，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞的陽性率或平均熒光強(qiáng)度，未標(biāo)記的DCs作為流式檢測(cè)設(shè)門對(duì)照，最后用FlowJo軟件分析。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）收集imDC，實(shí)驗(yàn)方法與分組同1.2.2。48 h后，收集培養(yǎng)細(xì)胞的上清，用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)IL-10的含量。

1.2.5混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)收集imDC，實(shí)驗(yàn)方法與分組同1.2.2。48 h后，將DCs作為刺激細(xì)胞（1×104個(gè)/mL），淋巴細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）作為應(yīng)答細(xì)胞，兩者以1∶10的比例接種于24孔板中共培養(yǎng)5 d，再用100 μL PBS重懸，用anti-CD4+FITC和7-AAD的抗體標(biāo)記淋巴細(xì)胞，最終用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+7-AAD-的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 Real-time PCR用Trizol法提取經(jīng)10%含藥血清與10%空白血清作用48 h的DCs總RNA，再將2 μg總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成為cDNA，用Real-time PCR檢測(cè)各組吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）的相對(duì)表達(dá)量，并用相對(duì)于管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate de?hydrogenase，GAPDH）的倍數(shù)表示，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。引物序列如下：IDO（84 bp），上游為5′-GCCCTTCAAGTGTTTC ACCAA-3′，下游為5′-CCTTTCCAGCCAGACAAATATATG-3′；GAPDH（89 bp），上游為5′-TGCACCACCAACTGCTTAG C-3′；下游為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1丹柴合劑對(duì)DCs表型的影響imDC空白血清組、imDC含藥血清組、imDC+LPS空白血清和imDC+ LPS含藥血清組CD86陽性細(xì)胞百分率分別為（39.50±6.20）%、（16.95±2.05）%、（75.15±1.75）%、（56.00±3.10）%（F=132.52，P＜0.05），見圖1。經(jīng)丹柴合劑作用后，imDC組和經(jīng)LPS刺激的imDC組CD86陽性細(xì)胞百分率均顯著降低，分別低于其對(duì)照組57.09%（P＜0.05）和25.48%（P＜0.05）。4組CD11b陽性細(xì)胞百分率分別為（5.13±0.99）%、（10.16±0.95）%、（4.91±0.46）%、（6.64±0.44）%（F= 31.02，P＜0.05），見圖1。imDC組與經(jīng)LPS刺激的imDC組CD11b陽性細(xì)胞百分率分別高于其對(duì)照組49.51%和35.23%（P＜0.05）。

此外，4組的HLA-DR平均熒光強(qiáng)度分別為1 252.00±211.00、901.00±41.00、1 784.50±113.50、1 436.00±92.00（F=24.11，P＜0.05），見圖1。經(jīng)該制劑作用后，imDC組與經(jīng)LPS刺激的imDC組HLADR平均熒光強(qiáng)度均顯著降低，分別低于其對(duì)照組28.04%和19.53%（P＜0.05）。綜上，丹柴合劑可使共刺激分子CD86和抗原提呈分子HLA-DR表達(dá)降低，使DCregs的特征性表面分子CD11b表達(dá)增強(qiáng)。

Fig. 1 The phenotypic characteristics of DCs treated with Danchaiheji圖1丹柴合劑對(duì)DCs表型的影響

2.2丹柴合劑對(duì)DCs分泌細(xì)胞因子的影響imDC空白血清組、imDC含藥血清組、imDC+LPS空白血清組與imDC+LPS含藥血清組分泌的IL-10濃度分別為（108.50±5.20）、（127.17±4.55）、（168.50±4.90）、（209.30±8.50）ng/L（F=168.25，P＜0.05），見圖2。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與imDC和imDC+LPS空白血清組比較，丹柴合劑均能促進(jìn)DCs分泌DCregs的特異性標(biāo)志物IL-10（P＜0.05）。

Fig. 2 The cytokine production of DCs treated with Danchaiheji圖2丹柴合劑對(duì)DCs分泌細(xì)胞因子的影響

2.3丹柴合劑對(duì)T細(xì)胞增殖能力的影響imDC空白血清組、imDC+LPS空白血清組與imDC+LPS含藥血清組T細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度分別為1 062.50± 22.50、1 641.00±138.00、1 024.00±83.00（F=40.67，P＜0.05），見圖3。研究發(fā)現(xiàn)，隨著imDC分化成熟，其刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力也隨之增強(qiáng)（P＜ 0.05），而丹柴合劑可顯著降低經(jīng)LPS刺激的DCs誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖能力（P＜0.05），提示丹柴合劑能顯著抑制DCs介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖作用。

Fig. 3　 The effects of Danchaiheji on the proliferation of T cells圖3丹柴合劑對(duì)T細(xì)胞增殖能力的影響

2.4丹柴合劑在mRNA水平對(duì)IDO表達(dá)的影響經(jīng)丹柴合劑作用后的imDC+LPS組IDO的相對(duì)表達(dá)量高于空白血清組近1.5倍（6.65±0.40 vs 4.73±0.23，F(xiàn)=471.22，P＜0.05），見圖4，提示該制劑可促進(jìn)DCs高表達(dá)IDO。

Fig. 4 The relative transcription levels of IDO by real-time PCR圖4 Real-time PCR檢測(cè)IDO基因的相對(duì)表達(dá)量

3　討論

3.1治療免疫排斥反應(yīng)的現(xiàn)狀一直以來，免疫排斥反應(yīng)是治療器官移植和自身免疫性疾病的難點(diǎn)與重點(diǎn)。目前在免疫排斥反應(yīng)的治療中，療效最為確切的是免疫抑制劑。理想的免疫抑制劑具有高效、低毒、方便和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，然而目前在臨床上投入使用的免疫抑制劑大多存在廣泛而強(qiáng)烈的毒副作用，長期服用可使患者的免疫功能下降，抗感染能力降低，甚至引起強(qiáng)烈的肝腎毒性[5]。例如肝移植常用的免疫抑制劑環(huán)孢素A、他克莫司等藥物的神經(jīng)毒作用已屢見報(bào)道，兩者可出現(xiàn)頭痛、癲癇、震顫、失明、局灶性腦白質(zhì)病等神經(jīng)系統(tǒng)病變[6]。因此，誘導(dǎo)患者產(chǎn)生針對(duì)移植物抗原和自身抗原的免疫耐受是治療器官移植后免疫排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的關(guān)鍵。

3.2 DCregs的免疫調(diào)節(jié)性能DCs根據(jù)其分化成熟的不同狀態(tài)可分為imDCs和成熟樹突狀細(xì)胞（mature dendritic cells，mDCs）。imDCs低表達(dá)共刺激分子并產(chǎn)生大量抗炎細(xì)胞因子，抑制免疫應(yīng)答，而mDCs與imDCs恰恰相反，其高表達(dá)共刺激分子并產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[7-8]。近年來，DCregs誘導(dǎo)的免疫耐受作用備受關(guān)注，在器官移植免疫排斥反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療中具有潛在的前景[2]。誘導(dǎo)產(chǎn)生DCregs的方法很多，如免疫抑制劑[9]、基質(zhì)細(xì)胞[10]、生物制劑[11]。但由于大多數(shù)免疫抑制劑可降低機(jī)體的免疫功能，甚至具有肝腎毒性和神經(jīng)毒作用，給患者帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，尋找一種經(jīng)濟(jì)、安全而又能高效獲得DCreg的方法具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3.3丹柴合劑的免疫調(diào)節(jié)性能本研究旨在克服上述不足之處，根據(jù)多年的臨床實(shí)踐，反復(fù)臨床驗(yàn)證拆方組方，提供一種安全、經(jīng)濟(jì)、有效誘導(dǎo)免疫耐受的中藥復(fù)方制劑——丹柴合劑。其配伍原理為少陽肝膽，病機(jī)為正邪相爭，調(diào)理肝膽，使邪證兩孤立，則可誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)病邪的免疫耐受。此方以柴胡為君，疏肝解表，白芍、郁金為臣，疏肝活血，肝藏血，佐以牡丹皮涼血，甘草調(diào)和諸藥為使。肝體陰而用陽，白芍養(yǎng)肝之體，柴胡助肝之用；肝主氣而藏血，柴胡理氣，郁金活血；氣有余便是火，更加牡丹皮涼血清熱?？v觀全方，攻補(bǔ)皆施，氣血同調(diào)，實(shí)為調(diào)理肝膽以誘導(dǎo)免疫耐受之良方。本文通過大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DCs經(jīng)丹柴合劑作用后可誘導(dǎo)分化為一種高表達(dá)CD11b，低表達(dá)CD86與HLA-DR的DCs亞型，該DCs亞型可促進(jìn)細(xì)胞因子IL-10的分泌。此外，將LPS刺激后的DCs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，該制劑可顯著抑制DCs介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖能力。IDO是一種調(diào)控色氨酸的代謝酶，其通過犬尿氨酸通路調(diào)控色氨酸的代謝，IDO還可抑制T細(xì)胞活化和增殖參與誘導(dǎo)免疫耐受[12]。大量研究報(bào)道，IDO在誘導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮重要的作用，可用于治療器官移植后排斥反應(yīng)、自身免疫性關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)丹柴合劑可誘導(dǎo)DCs使IDO基因表達(dá)上調(diào)。

3.4前景展望綜上，丹柴合劑通過上調(diào)IDO表達(dá)將DCs誘導(dǎo)分化為具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的DCregs，從而誘導(dǎo)免疫耐受。這些發(fā)現(xiàn)在器官移植免疫排斥反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療中具有潛在的前景，為DCregs的靶向治療和細(xì)胞治療提供了進(jìn)一步的支持。

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（2015-10-23收稿2015-10-30修回）

（本文編輯李鵬）

The differential effects of traditional Chinese medicine Danchaiheji on dendritic cells

LI Yingxi1, CHEN Dan2, WANG Xiaodong2, JING Yaqing1, LI Keqiu1, LI Guang1
1 Department of Biology, Basic Medical College, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China;
2 Department of Pharmacology, Basic Medical College Corresponding Author E-mail：lig@tmu.edu.cn

Abstract:Objective To explore the effects of traditional Chinese formula Danchaiheji on the differentiation of regula?tory dendritic cells (DCs) and the underlying mechanism. Methods The rat blood serums with or without the formula Dan?chaiheji were prepared. The peripheral blood mononuclear cells were separated from the peripheral venous blood of healthy donors. CD14+monocytes were isolated using CD14+magnetic beads and cultured for 5-7 days to obtain immature dendritic cells (imDCs). Then the cells was divided into control group and Danchaiheji containing rat serum group. Control group was divided into two subgroups (containing LPS and without LPS). Danchaiheji containing rat serum group was also divided into two subgroups (containing LPS and without LPS). The surface markers CD86, CD11b and HLA-DR of DCs were detected by flow cytometry. The level of IL-10 was determined by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The proliferation of al?logeneic T-cells was detected by flow cytometry and the expression level of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) was deter?mined using quantitative real-time PCR. Results DCs treated with the formula Danchaiheji exhibited high CD11b and low CD86 and HLA-DR expression levels as well as promoted the secretion of IL-10. In addition, the drug could inhibit the pro?motion of DCs on the proliferation of T cells, which was associated with the up-regulation of IDO expression. Conclusion The traditional Chinese formula Danchaiheji can induce the differentiation of DCs into regulatory DCs and play a role in in?hibitory effect on immune function.

Key words:dendritic cells；immune tolerance；indoleamine-pyrrole 2,3,-dioxygenase; regulatory dendritic cells；immu?nomodulation

中圖分類號(hào)：R392.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150255

基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助項(xiàng)目（2012AA021003）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21177091）

作者簡介：李穎曦（1990），女，碩士在讀，主要從事免疫耐受方面研究

通訊作者E-mail：lig@tmu.edu.cn