萬浩芳　萬海同　韓進　何昱（浙江中醫(yī)藥大學，浙江　杭州　310053）

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生芎配伍方對腦缺血性損傷大鼠的抗栓纖溶作用*

萬浩芳萬海同韓進何昱△
（浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053）

【摘要】目的觀察生芎配伍方對腦缺血性損傷大鼠模型的抗栓及纖溶作用，探討其抗腦缺血損傷的相關(guān)機制。方法將SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、生芎配伍方高、中、低劑量組。用MCAO法制作腦缺血損傷大鼠模型，并測定各組大鼠腦組織中6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）的含量，檢測血漿組織型纖溶酶原激活物（t-PA）及其抑制物（PAI）的活性。同樣用4VO法制作腦缺血損傷模型，觀察腦組織內(nèi)皮素-1（ET-1）基因表達的變化情況。結(jié)果腦缺血組6-Keto-PGF1α含量、血漿t-PA活性與假手術(shù)組比較降低，而TXB2含量、PAI活性水平則升高，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05或P＜0.01）；生芎配伍方高、中劑量組6-Keto-PGF1α含量、血漿t-PA活性與腦缺血組比較均升高，而TXB2含量、PAI活性水平則降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05或P＜0.01）。假手術(shù)組左側(cè)與右側(cè)腦組織中ET-1基因表達，差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05），而腦缺血組與生芎配伍方組缺血側(cè)腦皮層（左側(cè)）ET-1基因表達則高于自身健側(cè)相應(yīng)腦皮層區(qū)（右側(cè)），差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），腦缺血組也高于假手術(shù)組缺血側(cè)腦皮層ET-1基因表達，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；生芎配伍方高、中劑量組缺血側(cè)腦皮層ET-1基因表達則低于腦缺血組缺血側(cè)，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），但仍高于其自身健側(cè)相應(yīng)腦區(qū)，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。結(jié)論生芎配伍方可能通過抗凝、抗栓、增強纖溶活性、抑制ET-1基因表達等發(fā)揮治療腦缺血損傷的作用。

【關(guān)鍵詞】腦缺血生芎配伍方血栓6-Keto-PGF1αTXB2t-PA PAI ET-1

中風病從古至今均屬危急重癥，缺血性中風病更為多見［1］。其病理過程非常復雜，發(fā)病機制涉及腦組織能量代謝紊亂、自由基損傷、興奮性氨基酸毒性、炎癥反應(yīng)等多環(huán)節(jié)。缺血性腦中風作為神經(jīng)系統(tǒng)常見病、多發(fā)病之一，具有高致殘率、高致死率等特點，給患者及家屬帶來了巨大的痛苦［2］。腦動脈粥樣硬化、微栓塞、心臟疾病、血流動力學改變等因素則是造成短暫腦缺血發(fā)作的重要病因。隨著社會經(jīng)濟的不斷發(fā)展、物質(zhì)水平的提高、居民飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的變化，腦缺血發(fā)病率不斷上升，成為目前嚴重威脅人類健康的疾病之一。因此，采取有效防治措施、尋找療效更好的藥物有著重要意義。本研究主要觀察生芎配伍方對腦缺血性損傷大鼠的影響及治療作用，生芎配伍方主要由生地黃、川芎等組成，該方具有養(yǎng)陰生津、益氣活血等作用，項目組前期研究表明養(yǎng)陰活血方藥對培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞具有抗栓消凝等作用，在某些指標改善方面優(yōu)于活血化瘀類中藥［3］。生芎配伍方多項實驗研究表明該類方藥具有顯著的抗腦缺血損傷作用［4-7］，因此筆者對生芎配伍方在腦缺血損傷中抗栓、纖溶的作用及相關(guān)機制展開了研究。現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1藥物生芎配伍方中的藥材均購于杭州泰仁堂（浙江中醫(yī)藥大學第二門診部）。

1.2動物SD大鼠，雄性，清潔級，體質(zhì)量320～350 g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.3造模與分組1）腦缺血損傷大鼠模型分別采用Pulsinelli的四血管阻斷法（4VO法）［8］和Belayev的大腦中動脈局灶性栓塞法（MCAO）［9］制作。4VO法腦缺血大鼠在頸總動脈夾夾閉45 min后放開動脈夾，使血液流通60 min后從腹主動脈取血，并迅速斷頭取腦:假手術(shù)組于手術(shù)后105 min取材。MCAO法阻斷大鼠大腦中動脈血流45 min，從而制成大鼠大腦中動脈缺血模型，隨后輕取出尼龍線再灌注。模型組與用藥組缺血再灌注24 h后斷頭取材，假手術(shù)組除不阻斷大鼠大腦中動脈血流外，其他手術(shù)步驟與模型組相同。2）大鼠腦缺血模型制作完成后，隨機分為假手術(shù)組，腦缺血組，生芎配伍方高、中、低劑量組［劑量分別為8、4、2 g/（kg·d）］，每組8只。

1.4給藥方法生芎配伍方按照上述劑量灌胃給藥，每天早晚各1次，連續(xù)給藥3 d，在手術(shù)前1 h追加1次。假手術(shù)組、腦缺血組按照同樣方法灌胃等量生理鹽水。

1.5觀察指標與檢測方法1）6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）、血漿組織型纖溶酶原激活物（t-PA）及其抑制物（PAI）測定。4VO法制作大鼠腦缺血模型，再灌注24 h后用酶聯(lián)免疫法測定腦勻漿液6-Keto-PGF1α及TXB2的含量；發(fā)色底物法測定血漿t-PA及PAI的活性變化。試劑盒均購自浙江澤宏試劑公司，并依照試劑盒說明進行操作。2）ET-1基因表達水平測定。應(yīng)用ET-1基因原位雜交及圖像分析，MCAO法制作大鼠腦缺血模型，再灌注24 h后迅速斷頭取腦，將腦組織置于-40℃的冰箱中凍結(jié)后迅速冰凍切片，行冠狀連續(xù)切片（15 μm），再經(jīng)4%的多聚甲醛固定，用PBS洗滌和乙醇脫水，蛋白酶K在37℃下消化，用多聚甲醛再固定。樣品經(jīng)PBS洗后再進行預雜交和雜交，所用試劑均經(jīng)RNA酶抑制劑DEPC處理。按說明書進行ET-1基因探針與地高辛精標記探針的標記、預雜交和雜交及顯色反應(yīng)，用圖像分析儀進行分析。

2　結(jié)果

2.1各組腦缺血大鼠腦皮質(zhì)6-Keto-PGF1α、TXB2含量水平比較見表1。腦缺血組6-Keto-PGF1α含量與假手術(shù)組比較降低，而TXB2含量水平則升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；生芎配伍方高、中劑量組6-Keto-PGF1α含量與腦缺血組比較均升高，而TXB2含量水平則降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05或P＜0.01）。

表1　各組腦缺血大鼠腦皮質(zhì)6-Keto-PGF1α、TXB2含量水平比較（pg/mg，

表1　各組腦缺血大鼠腦皮質(zhì)6-Keto-PGF1α、TXB2含量水平比較（pg/mg，

與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與腦缺血組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別　n　6-Keto-PGF1α　TXB2假手術(shù)組　8　13.65±1.63　454.7±42.3腦缺血組　8　7.14±0.86**　1620.8±212.9**高劑量組　8　10.78±0.79△△　765.3±79.3△△中劑量組　8　9.12±0.93△　960.2±91.5△△低劑量組　8　7.83±0.72　1443.6±160.4

2.2各組腦缺血大鼠血漿t-PA活性和PAI活性比較見表2。腦缺血組血漿t-PA活性與假手術(shù)組比較降低，而PAI活性則升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；生芎配伍方高、中劑量組血漿t-PA活性與腦缺血組比較均升高，而PAI活性則降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

表2　各組腦缺血大鼠血漿t-PA活性和PAI活性比較

表2　各組腦缺血大鼠血漿t-PA活性和PAI活性比較

組別　n　PAI/t-PA假手術(shù)組8　0.704腦缺血組8　1.797高劑量組8　0.948中劑量組8　1.077低劑量組8　1.531 t-PA（IU/mL）　PAI（IU/mL）0.926±0.043　0.652±0.027 0.521±0.025**　0.936±0.032**0.744±0.031△△　0.705±0.029△△0.725±0.036△△　0.781±0.033△△0.582±0.025　0.891±0.041

2.3各組對大鼠腦缺血后腦組織ET-1基因表達水平比較見表3。假手術(shù)組左側(cè)與右側(cè)腦組織中ET-1基因表達，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），而腦缺血組與生芎配伍方高劑量組缺血側(cè)腦皮層（左側(cè)）ET-1基因表達則高于自身健側(cè)相應(yīng)腦皮層區(qū)（右側(cè)），差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），腦缺血組腦皮層ET-1基因表達也高于假手術(shù)組缺血側(cè)，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；生芎配伍方高劑量組缺血側(cè)腦皮層ET-1基因表達則低于腦缺血組缺血側(cè)，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），但仍高于其自身健側(cè)相應(yīng)腦區(qū)，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

表3　各組腦缺血大鼠腦組織ET-1基因表達水平比較

表3　各組腦缺血大鼠腦組織ET-1基因表達水平比較

與本組右側(cè)腦皮層比較，*P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P＜0.01；與腦缺血組比較，▲P＜0.01。

組　別　n　左側(cè)（腦缺血側(cè)）　右側(cè)（健側(cè)）假手術(shù)組　6　216.7±29.6　193.2±26.4腦缺血組　6　523.5±60.4*△　224.6±30.5高劑量組　6　387.1±52.3*▲　241.2±37.8

3　討論

大量研究證實，血液灌流恢復后，腦缺血損傷進一步加重，即存在“腦缺血/再灌注損傷”［10］。本實驗依據(jù)經(jīng)典方法制作大鼠腦缺血再灌注模型，觀察生芎配伍方對6-Keto-PGF1α與TXA2含量及ET-1基因表達的影響，同時也觀察對其對t-PA活性與PAI活性的調(diào)節(jié)作用，從而探討并證實生芎配伍方具有良好的抗栓和抗腦缺血損傷的作用。

PGI2和TXA2為花生四烯酸的代謝產(chǎn)物?；ㄉ南┧峤?jīng)環(huán)氧酶生成的PGH2，在PGI2合成酶作用下生成PGI2，在TXA2合成酶作用下生成TXA2［9］。TXA2誘導血小板聚集，而PGI2則抑制血小板聚集。PGI2與TXA2作用相反，它能夠強烈抑制血小板聚集的生物活性，最終產(chǎn)生抗血栓作用。但是TXA2的生物半衰期很短，僅僅只有30 s，它會迅速轉(zhuǎn)化為無活性的TXB2，因此本項目檢測的為TXB2的含量。本研究結(jié)果示，當腦缺血再灌注時，腦組織6-Keto-PGF1α含量降低，TXB2含量升高。生芎配伍方能明顯提高6-Keto-PGF1α含量，降低腦組織中TXB2的含量，證實了生芎配伍方具有改善腦血管通透性、抗腦血管痙攣、抗凝抗栓等作用。

t-PA與PAI-1是由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，是人體纖溶系統(tǒng)中具有相互制約作用的一對生物活性物質(zhì)，也是人體纖溶系統(tǒng)的重要組成部分，在纖溶活性方面有著重要的調(diào)節(jié)作用。t-PA具有高度的纖維蛋白特異性，能夠清除血管床上的纖維蛋白沉積，從而促進生理性纖溶；PAI在血漿中處于活性狀態(tài)與無活性狀態(tài)之間的動態(tài)平衡模式，它是t-PA的快速抑制劑。t-PA可清除正常血液循環(huán)中的纖維蛋白，內(nèi)皮釋放的t-PA約95%被過量的PAI快速結(jié)合失去活性［11］。t-PA和PAI-1既是纖溶系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，也是內(nèi)皮細胞功能的標志蛋白，二者的異常變化，直接影響到纖溶系統(tǒng)的活性，進而破壞凝血纖溶平衡［12］。t-PA過高和（或）PAI-1降低，致纖溶活性亢進，可以導致出血癥狀；t-PA過低和（或）PAI-1增高，致纖溶活性降低，可以導致血栓形成。本研究表明，大鼠腦缺血損傷時，PAI的活性明顯提高，而t-PA的活性則明顯降低，使之處于高凝低纖溶狀態(tài)，表明生芎配伍方能有效抑制PAI活性，同時可以升高t-PA活性，其具有良好的抗栓抗凝等作用。

ET是具有較強作用的長效血管收縮劑，對血栓形成起著重要作用。ET從血管內(nèi)皮釋放后，首先與靶細胞表面受體結(jié)合引起多種膜上反應(yīng)，激活磷脂酶C，此酶水解生成三磷酸肌醇脂（IP3）、四磷酸肌醇脂（IP4）和二酰甘油（DAG），其中IP3和IP4可促進細胞外鈣內(nèi)流和細胞內(nèi)動員，升高細胞內(nèi)鈣濃度，而DAG又可激活蛋白激酶C（PCK），鈣升高和PCK激活可引起血管收縮。血漿ET含量升高與許多疾病的嚴重程度呈正相關(guān)趨勢，如神經(jīng)系統(tǒng)損害越嚴重，血漿ET含量越高。本實驗結(jié)果表明，缺血腦皮層ET-1基因表達增高。生芎配伍方能顯著抑制缺血組缺血側(cè)皮層ET-1基因表達，表明其可調(diào)節(jié)血管舒縮功能，抗血栓，改善腦缺血狀態(tài)。

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·研究報告·

The Antithrombotic and Fibrinolysis Effects of Shengxiong Compatibility Prescription on Cerebral Ischemia Injury

WAN Haofang，WAN Haitong，HAN Jin，et al.Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

【Abstract】Objective: To study the anticoagulant and fibrinolysis effects of Shengxiong compatibility prescription （SCCP）on rats with cerebral ischemic injury and to find the mechanism of its anti cerebral ischemia injury.Method: MCAO model rats with cerebral ischemic injury were randomized into the sham-operation group，the model group，three SCCP-treated groups（high dose group，middle dose group and low dose group）.The contents of prostacyclin（PGI2）and thromboxane B2（TXB2）in brain tissue，the plasma tissue-type plasminogen activator（t-PA）and plasminogen activator inhibitor（PAI）and the gene expression of endothelin-1（ET-1）were detected in each group.Results: SCCP could significantly increase the content of PGI2，decrease the level of TXB2in brain tissue，regulate the activities of plasma t-PA and PAI，and reduce the gene expression of ET-1 in the side of ischemia cerebral cortex.Conclusion: SCCP provides anticoagulation，improve fibrinolytic activity and reduce ET-1 gene expression，which may be the mechanism of YTG′s anti-cerebral ischemia injury.

【Key words】Cerebral ischemia；Shengxiong compatibility prescription；Thrombosis；6-Keto-PGF1α；TXB2；t-PA；PAI；ET-1

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1004-745X（2016）01-0001-03

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.01

*基金項目：國家自然科學基金項目（81374053，81403284）；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目

通信作者△（電子郵箱：heyu0923@sina.com）

收稿日期（2015-08-01）