周芳芳，熊濤

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

3株中度嗜鹽菌的分離鑒定與生長特性研究

周芳芳，熊濤

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

[摘要]將湖北省荊州拍馬造紙廠的高鹽污水，采用平板劃線法篩選并純化培養(yǎng)后，得到3株單菌落，通過觀察菌落的顏色、形狀和鞭毛等特征，將菌液進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)、需氧性試驗(yàn)和淀粉水解等生理生化試驗(yàn)，可將這3株菌株初步鑒定為鹽單胞菌屬(Halomonas)，都屬于中度嗜鹽菌。耐鹽度試驗(yàn)結(jié)果顯示，3株菌株能在1.5%～20.0%NaCl中生長，且最適生長濃度為12.0%。pH生長試驗(yàn)表明最適生長pH為7.0。

[關(guān)鍵詞]高鹽污水；中度嗜鹽微生物；鹽單胞菌屬(Halomonas)

中度嗜鹽菌的分布廣泛,鹽生長濃度寬(但通常要低一些),對(duì)營養(yǎng)的要求低，易于適應(yīng)環(huán)境[3]。中度嗜鹽菌的用途很廣泛且由來已久，比如Tetragenococcus的菌株很久以前就被用于食品如醬油等的發(fā)酵中。人們對(duì)它們潛在的生物技術(shù)應(yīng)用充滿了興趣。目前對(duì)中度嗜鹽菌應(yīng)用方面的研究主要集中在對(duì)它們產(chǎn)生的酶和一些功能性分子、大分子多聚物以及生物環(huán)保等方面[4,5]。本研究從高鹽污水中分離出3株嗜鹽菌，通過對(duì)不同鹽濃度下的生長情況及生理生化特性分析，確定為中度嗜鹽菌,可為研究中度嗜鹽菌在生物技術(shù)應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用高鹽污水來自湖北省荊州拍馬造紙廠。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基配制

CM培養(yǎng)基:將酸性水解酪蛋白7.5g、酵母浸出物10g、檸檬酸鈉3g、MgSO4·7H2O 20g、KCl 2g、檸檬酸鐵0.004g、NaCl 98.9g加水至1000mL[6]。

Gibbons改良培養(yǎng)基:將酪蛋白氨基酸5g、酵母浸出物10g、細(xì)菌蛋白胨5g、檸檬酸鈉3g、KCl 2g、MgSO4·7H2O 20g、NaCl 120g、瓊脂18g加水至1000mL[7]。

ATCC213培養(yǎng)基: MgSO4·7H2O 20g、KCl 5g、CaCl2·6H2O 0.2g、酵母提取物10g、Tryptone 5g、NaCl 180g加水至1000mL[8]。

1.2.2菌株的篩選、分離與純化

菌株的篩選：采用恒溫?fù)u床培養(yǎng),各取0.2mL水樣分別加入到3支裝有150mL CM培養(yǎng)基的三角瓶中,放入到30℃150r/min的搖床中培養(yǎng)5d。

菌株的分離：將培養(yǎng)液稀釋到10-6,準(zhǔn)確吸取適當(dāng)稀釋度的菌液0.1mL均勻涂布在含12%NaCl Gibbons平板上,在37℃培養(yǎng)24h,觀察菌落形態(tài)[9]。

菌株的純化：分別用接種環(huán)挑取不同菌落,用劃線法在改良的Gibbons培養(yǎng)基上純化分離出來的菌種,固體培養(yǎng)于加有少量蒸餾水的塑料袋中,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后挑選單菌落,反復(fù)劃線,直至獲得純菌[10]，并做好標(biāo)記。

1.2.3形態(tài)學(xué)特征觀察

觀察菌落形狀、顏色、大小、濕度、透明度、邊緣及有無鞭毛等形態(tài)特征。

1.2.4耐鹽菌和嗜鹽菌的鑒別

將分離純化的菌株分別浸泡在蒸餾水中放置24h后，用光學(xué)顯微鏡觀察到這3種菌有變形和破壁的現(xiàn)象發(fā)生。

1.2.5生理生化特性試驗(yàn)

包括革蘭氏染色試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、需氧性試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、纖維素分解試驗(yàn)、乙酰甲基醇反應(yīng)、檸檬酸反應(yīng)，是否產(chǎn)生吲哚、產(chǎn)氨試驗(yàn)，是否水解淀粉試驗(yàn)。

1.2.6最適生長pH的測定

將所分離出來的3株菌株按2% 的接菌量分別接入到不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的改良Gibbons固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，觀察是否生長并做好標(biāo)記。

1.2.7耐鹽性測定

配制NaCl%為0.0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0的ATCC213液體培養(yǎng)基，以5%的接菌量接種，37℃搖床振蕩培養(yǎng)2～7d，用722型分光光度計(jì)于 460nm波長處測光密度值。

1.2.8藥敏試驗(yàn)

將分別浸有青霉素、卡拉霉素、慶大霉素、氯霉素、氧氟沙星和利福平等抗生素的厚濾紙片放在預(yù)先涂布好細(xì)菌的Gibbons培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)，觀察抗菌素對(duì)它們有無抑制作用。

2結(jié)果與分析

2.1菌落形態(tài)

圖1　初次篩選的菌落形態(tài)

經(jīng)過初篩，分離出淡粉色、乳白色、橙黃色3種顏色的菌落(圖1)。淡粉色菌落為小的圓形菌落，規(guī)則、濕潤、有光澤；乳白色菌落為大而不規(guī)則的圓形菌落，濕潤、有光澤；橙黃色菌落為大的圓形菌落，規(guī)則、濕潤、有光澤。

采用劃線平板法將3種顏色的菌落分別純化培養(yǎng)后，得到3株菌株分別暫定為1號(hào)(淡粉色)、2號(hào)(乳白色)、3號(hào)(橙黃色)菌株。其形態(tài)特征分別如圖2和表1所示。

由文獻(xiàn)[11]可知，嗜鹽菌和耐鹽菌多數(shù)呈淡乳色、淡粉、淡黃及橙黃色的圓形菌落。為此，將3種菌株分別浸泡在蒸餾水中放置24h后，用光學(xué)顯微鏡觀察到這3種菌株是否有變形和破壁的現(xiàn)象發(fā)生，以鑒別它們是耐鹽菌還是嗜鹽菌。試驗(yàn)結(jié)果表明，3種菌株在蒸餾水中放置24h有變形和破壁現(xiàn)象。根據(jù)文獻(xiàn)[12]可判定分離出來的3種菌株并不是耐鹽菌，而為嗜鹽菌。

圖2　3種顏色的菌落純化培養(yǎng)結(jié)果

1號(hào)菌株2號(hào)菌株3號(hào)菌株顏色淡粉乳白橙黃細(xì)胞形狀桿狀桿狀短桿運(yùn)動(dòng)性+--鞭毛單鞭毛周毛周毛

表2　3株菌株的生理生化特性

注：“+”陽性；“-”陰性。

表3　菌株在不同pH下生長情況

注：“”表示生長良好；“+”表示生長；“-”表示不生長。

2.2生理生化特征

3種菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。根據(jù)生理生化特性，結(jié)合菌落的形態(tài)特征，也可初步判定分離的3株菌株是嗜鹽菌。

圖3　不同NaCl濃度下3株菌株的生長情況

2.3最適生長pH

菌株在不同pH下生長情況如表3所示，可見3株菌株生長的最適pH均為7。

2.4耐鹽度曲線

3種菌株的最適NaCl濃度均為12.0%，且在鹽濃度低于1.5%和高于20.0%時(shí)均不生長，從圖3明顯可見3種菌株的生長速度依次是：2號(hào)>3號(hào)>1號(hào)。

2.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果

1號(hào)菌株對(duì)氯霉素、利富平、氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素敏感，對(duì)氧氟沙 星不敏感；2號(hào)菌株對(duì)氯霉素、利富平、氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素敏感，對(duì)氧氟沙星不敏感，且生長旺盛；3號(hào)菌株對(duì)氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、氧氟沙星不敏感，但對(duì)氯霉素、利富平敏感。

3討論

根據(jù)其形態(tài)及生理生化、藥敏試驗(yàn)結(jié)果并參考伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)可知，本研究分離出的3種菌株符合鹽單胞菌屬的特征，即能在含1.5%～20.0%NaCl的培養(yǎng)基中生長,其最適NaCl生長濃度為12.0%,在蒸餾水中有變形和破壁的現(xiàn)象,為革蘭氏陰性桿菌,好氧或兼氧,極生叢毛運(yùn)動(dòng)或不運(yùn)動(dòng),不液化明膠,產(chǎn)H2S,pH生長范圍在5.5～8.0之間,最適pH在7.0左右。但具體種類還有待于DNA雜交以及16S rDNA序列分析后才能最終做出結(jié)論。

由于造紙廠廢水、砷礦廢水及許多人類活動(dòng)造成的小環(huán)境是高鹽或高鹽堿的，而中度嗜鹽菌在這類環(huán)境中可以很好地生存，而且中度嗜鹽菌作為最基礎(chǔ)的代謝者，配合著酵母、原蟲等其他微生物，可以將許多對(duì)人類和動(dòng)植物有害的物質(zhì)改造成為低害甚至無害的物質(zhì)釋放出來，所以，中度嗜鹽菌的這一生理特點(diǎn)，使得其在環(huán)保方面有良好的應(yīng)用前景。

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[收稿日期]2016-02-28

[作者簡介]周芳芳 (1989-)，女，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物基因工程疫苗。通信作者：熊濤，xiongtao@hotmail.com。

[中圖分類號(hào)]X172

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2016)15-0059-04

[引著格式]周芳芳，熊濤.3株中度嗜鹽菌的分離鑒定與生長特性研究[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2016，13(15)：59～62.