汪琛媛，李　瑛，汪永忠

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥　230031)

痺苓祛痛顆粒的UPLC指紋圖譜研究

汪琛媛1,2，李瑛2，汪永忠1,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230031)

摘要：目的建立超高效液相色譜法(UPLC)研究痺苓祛痛顆粒指紋圖譜，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。 方法色譜柱為Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫；流速為0.25 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。結(jié)果建立了10批痺苓祛痛顆粒的共有圖譜，相似度均大于0.97，確定了13個(gè)共有峰。結(jié)論所建立的痺苓祛痛顆粒的指紋圖譜特征性和專屬性強(qiáng)，該方法可用于痺苓祛痛顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：色譜法,高壓液相;質(zhì)量控制;痺苓祛痛顆粒

痺苓袪痛顆粒為安徽省中醫(yī)院特色制劑，處方源于名老中醫(yī)王正雨老先生的經(jīng)驗(yàn)方，根據(jù)中醫(yī)理論組方，處方由威靈仙、黃柏、當(dāng)歸、懷牛膝、虎杖、萆薢、澤瀉、薏苡仁、蒼術(shù)、土茯苓組成，諸藥合用具有清熱泄?jié)帷⒔舛净钛π?，主要治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期、間隙期，療效較好[1]。目前，對(duì)于質(zhì)量控制研究主要是應(yīng)用高效液相色譜等方法對(duì)幾種成分的含量進(jìn)行測(cè)定，來(lái)評(píng)價(jià)其質(zhì)量的優(yōu)劣[2]，然而，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的觀點(diǎn)來(lái)看，僅從指標(biāo)成分的含量控制還難以滿足對(duì)中藥質(zhì)量的全面控制的要求[3]。由藥材中單一或幾個(gè)化合物來(lái)對(duì)一種或幾種藥材定性或定量標(biāo)定是一種普遍現(xiàn)象，其控制的是中藥中的某部分組分，忽略了中藥中多種成分、多種機(jī)制的協(xié)同作用，難以全面衡量中藥的療效和質(zhì)量[4]。HPLC法具有分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，變化較多等缺點(diǎn)[5-6]。超高效液相色譜(UPLC)的分析效率更高，可顯著縮短分析時(shí)間，減少流動(dòng)相的消耗；UPLC 可檢測(cè)更微量的樣品，色譜分離效果更好、靈敏度更高,洗脫條件比變化更簡(jiǎn)單，色譜峰的漂移時(shí)間較短，在指紋圖譜軟件中色譜峰易于匹配等優(yōu)點(diǎn)[7]。參考文獻(xiàn)[8-10]本文采用UPLC法對(duì)痺苓祛痛顆粒指紋圖譜進(jìn)行測(cè)定，可有效控制該制劑的質(zhì)量。

1儀器與試藥

Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器以及Empower2色譜數(shù)據(jù)工作站；KQ3200DB型數(shù)控超聲清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；BP211D型電子天平(德國(guó)Sartorius)；大黃素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)110756-200110，供含量測(cè)定用)；乙腈為色譜純(美國(guó)TEDIA公司)；甲醇、磷酸等試劑均為分析純；蒸餾水(自制)。痺苓祛痛顆粒樣品(批號(hào)20140323、20140420、20140511、20140622、20140705、20140815、20140910、20141002、20141112、20141224，分別以S1～S10表示)，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫：26℃；流動(dòng)相：乙腈,0.05 %磷酸水溶液，采用梯度洗脫(流動(dòng)相梯度設(shè)置見(jiàn)表1)；流速為0.25 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：1.0 μL。

表1　流動(dòng)相梯度

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取大黃素對(duì)照品2.80 mg并置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備分別取痺苓祛痛顆粒樣品適量，研細(xì)，稱0.5 g置于10 mL容量瓶中，加100%甲醇定容，超聲處理30 min(250 W，40 kHz)，放冷，甲醇補(bǔ)充至刻度，搖勻，取上清液濾過(guò)即為供試品溶液。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn)取S1(批號(hào)為20140323)樣品供試品溶液，照2.3項(xiàng)下處理供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別進(jìn)樣2 μL，以考察儀器精密度得到的色譜，其色譜圖線能夠很好的重合，經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)計(jì)算，相似度均在0.98以上，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)以S2(20140420)樣品供試品溶液，照2.3項(xiàng)下方法制備供試品，以2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣2 μL，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣，記錄。經(jīng)中藥《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)評(píng)價(jià)，以考察儀器穩(wěn)定性得到的色譜，其色譜圖線能夠很好的重合，結(jié)果相似度均在0.97以上，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　痺苓祛痛顆粒指紋圖譜的精密度圖譜相似度

表3　痺苓祛痛顆粒指紋圖譜的穩(wěn)定性圖譜相似度

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)以S6(20140815)供試品溶液按2.3項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下方法的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)評(píng)價(jià)，相似度均在0.97以上，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　重復(fù)性結(jié)果

2.5痺苓袪痛顆粒指紋圖譜的建立與分析

2.5.1特征指紋圖譜測(cè)定取10批痺苓袪痛顆粒制劑成品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品，在2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜峰，將獲得各批樣品色譜信息處理成AIA格式，導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)得到其共有模式圖譜。共獲得13個(gè)峰，其中11號(hào)峰為大黃素，共有模式圖譜、大黃素對(duì)照品圖譜和10批樣品的疊加圖譜的色譜見(jiàn)圖1、圖2。

2.5.2特征指紋圖譜的結(jié)果分析對(duì)實(shí)驗(yàn)得出的10批痺苓袪痛顆粒的共有模式中的13個(gè)色譜峰的峰面積和出峰時(shí)間的平均值和RSD進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果表明各共有峰保留時(shí)間RSD均小于2 %；13個(gè)共有峰的峰面積RSD值在2.18 %～4.94 %之間，痺苓袪痛顆粒質(zhì)量較穩(wěn)定，平均峰面積結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　10批樣品特征指紋圖譜峰面積

表6　10批痺苓袪痛顆粒樣品的特征指紋圖譜相似度

圖1痺苓袪痛顆粒對(duì)照品和共有模式的色譜圖圖210批痺苓袪痛顆粒的UPLC特征指紋疊加圖譜

運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)對(duì)10批次的樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。選定色譜圖中13個(gè)色譜峰作為特征峰，進(jìn)行譜圖匹配，其中11號(hào)峰大黃素與相鄰峰分離度較好，且峰面積較適中，因此選定其為參比峰。通過(guò)指紋圖譜相似度軟件，對(duì)10批樣品進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示這10批次的樣品相似度大于0.97，說(shuō)明10批制劑整體工藝穩(wěn)定，質(zhì)量較均一，UPLC特征指紋圖譜可作為質(zhì)量控制方法。結(jié)果見(jiàn)表6。

3討論

比較了不同比例的甲醇—水(甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為0、50%、100%)溶劑對(duì)樣品的提取率，結(jié)果顯示，100%甲醇的提取率略高于其他溶劑。由于等度洗脫分離效果較差，使用乙腈—0.05 %磷酸水溶液進(jìn)行了不同的梯度洗脫優(yōu)化，結(jié)果顯示圖譜指紋性強(qiáng)，且各色譜峰大部分都得到了基線分離。采用DAD檢測(cè)器做全波長(zhǎng)掃描，考察不同吸收波長(zhǎng)圖譜，結(jié)果表明，254 nm處各成分具有較好的紫外吸收，色譜信息豐富，基線平穩(wěn)，而且避免了溶劑末端吸收的影響。

對(duì)10批制劑進(jìn)行UPLC的指紋圖譜研究，優(yōu)選出最佳色譜峰條件，建立了不同批次制劑的共有模式，并進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)。經(jīng)過(guò)提高后建立的質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)單易行、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，能有效全面的控制該藥品的質(zhì)量。

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UPLC fingerprint of bilingqutong granule

WANG Chen-yuan1,2,LI Ying2,WANG Yong-zhong1,2

(1.AnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei,Anhui230012;2.TheFirstAffiliatedHospital,AnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei,Anhui230031,China)

Abstract:Objective To establish an ultra high performance liquid chromatographic (UPLC) fingerprint for the quality control of bilingqutong granule，to provide a comprehensive evaluation for its quality control.Methods UPLC separation was performed on an Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) by gradient elution with 0.05 % phosphoric acid-acetonitrile as mobile phase.The flow rate was 0.25 mL·min-1and the detection wavelength was set at 254 nm.Results Thirteen characteristic common peaks of chemical constituents were identified and 10 batches of bilingqutong granule were analyzed.The quanlity of samples was assessed by Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (2004 A version).The similarities of 10 batches of bilingqutong granule were all over 0.97,and 13 characteristic peaks of UPLC fingerprint for bilingqutong granule were established.Conclusions The established UPLC fingerprint of bilingqutong granule is convenient and highly specific,which could be used to identify and evaluate the quality of bilingqutong granule.

Key words:Chromatography,High Pressure Liquid;Quality Control;bilingqutong granul

基金項(xiàng)目:安徽中醫(yī)藥大學(xué)臨床科學(xué)研究基金項(xiàng)目( No 2012LC1-016B)

通信作者:汪永忠，男，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥新藥研發(fā)，E-mail: wyzhmail@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.013

(收稿日期：2015-12-07,修回日期：2016-03-13)