焦衛(wèi)云，李　坦，李　斌，劉媛媛，胡雪瑩，鮑揚(yáng)漪

(合肥市第一人民醫(yī)院血液科，安徽 合肥　230023)

慢性期慢性粒細(xì)胞白血病患者BCR-ABL與PTEN關(guān)系的臨床觀察

焦衛(wèi)云，李坦，李斌，劉媛媛，胡雪瑩，鮑揚(yáng)漪

(合肥市第一人民醫(yī)院血液科，安徽 合肥230023)

摘要：目的探討慢性期慢性粒細(xì)胞白血病患者BCR-ABL和PTEN mRNA表達(dá)的變化及臨床意義。方法觀察43例慢性期慢性粒細(xì)胞白血病患者，基于6個(gè)月BCR-ABL是否下降≥10%分為兩組，比較組內(nèi)及組間PTEN表達(dá)水平的關(guān)系。 結(jié)果有效組患者初治時(shí)和伊馬替尼治療6個(gè)月后PTEN mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)，無(wú)效組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.455)。兩組患者6個(gè)月后PTEN表達(dá)水平較初治時(shí)升高倍數(shù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療有效組BCR-ABL與PTEN表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=3.174，P<0.01)。結(jié)論慢性粒細(xì)胞白血病中，PTEN表達(dá)量隨著BCR-ABL水平的變化而變化，并且治療有效組PTEN與BCR-ABL水平呈負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：白血病, 髓系, 慢性, BCR-ABL陽(yáng)性；伊馬替尼；PTEN

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種源于造血多能干細(xì)胞的常見惡性骨髓增殖性疾病，約占成人白血病的15%，好發(fā)于45～55歲的中老年患者[1]。其腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)特征為具有Ph染色體[2-3]，其融合基因編碼的蛋白引發(fā)腫瘤細(xì)胞的大量增殖。PTEN是一種重要的抑癌蛋白[4]，現(xiàn)認(rèn)為其在體內(nèi)多條通路均參與了調(diào)節(jié)作用[4-7]。近期的研究表明BCR-ABL有直接抑制PTEN的作用[8]。本試驗(yàn)通過(guò)觀察經(jīng)酪氨酸激酶抑制劑治療后慢性粒細(xì)胞白血病慢性期患者骨髓PTEN基因變化與BCR-ABL下降水平間的關(guān)系。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象收集2011年3月至2015年11月就診我院，經(jīng)臨床癥狀和骨髓細(xì)胞學(xué)及遺傳學(xué)確診的初治慢性期CML患者43例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。納入患者治療方式均為口服伊馬替尼400 mg·d-1。留取患者骨髓標(biāo)本，時(shí)間節(jié)點(diǎn)為兩次，分別于初治時(shí)和經(jīng)伊馬替尼治療6個(gè)月時(shí)?；颊叻纸M方案為基于PQ-PCR 通過(guò)特異性引物檢測(cè)BCR-ABL水平，再與對(duì)照基因的轉(zhuǎn)錄子數(shù)量進(jìn)行比較，BCR-ABL所占的比例乘以100得到的百分比，按照6個(gè)月≤10%和>10%分為兩組。疾病預(yù)后相關(guān)因素選取PFS[9]，定義為疾病未進(jìn)展到加速期或急變期。

1.2試劑與儀器人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Solarbio公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；普通PCR儀及定量PCR儀購(gòu)自ABI公司；生工生物工程(上海)有限公司合成RNA引物；白血病融合基因BCR-ABL檢測(cè)試劑盒(核酸擴(kuò)增熒光定量法)購(gòu)自上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3引物RNA引物參照GenBank中人PTEN和GAPDH 的基因序列設(shè)計(jì)，并比對(duì)哈佛引物庫(kù)內(nèi)引物序列，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，見表 1。BCR-ABL定量檢測(cè)使用BCR-ABL 檢測(cè)試劑盒按試劑盒說(shuō)明書操作。

表1　定量擴(kuò)增引物序列

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1RNA提取取抗凝骨髓5 mL，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離為單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞懸液最終定容為(5～10)×106·L-1，加入Trizol液1 mL混勻，按照氯仿法提取細(xì)胞總RNA，RNA含量及純度經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定。

1.4.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)細(xì)胞總RNA提取后，采用Oligo(dT)法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，待PCR檢測(cè)，具體操作見逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書。

1.4.3實(shí)時(shí)熒光PCRPTEN實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR反應(yīng)：SYBR GREEN反應(yīng)體系共25 μL；反應(yīng)條件為95℃ 15 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，設(shè)空白對(duì)照，采用ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)量，每組重復(fù)3次取均值。BCR-ABL數(shù)據(jù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出ABL 和BCR-ABL，BCR-ABL拷貝數(shù)取兩次結(jié)果的平均值。

2結(jié)果

2.1患者資料及分組情況本次試驗(yàn)共納入患者43例，年齡44(31±60)歲；男25例，女18例。納入實(shí)驗(yàn)的患者基于6個(gè)月時(shí)BCR-ABL下降水平，≤10%為有效組，>10%為失敗組，兩組基線資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2　患者基線資料及分組情況±s

2.2實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果患者骨髓標(biāo)本PTEN表達(dá)水平由PCR儀器自帶軟件產(chǎn)生數(shù)據(jù)，以Multicomponent Plot曲線加以描述，見圖1。患者初治時(shí)和伊馬替尼治療6個(gè)月后PTEN mRNA表達(dá)水平有效組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)，無(wú)效組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.455)，見圖 2。兩組間患者6個(gè)月后PTEN表達(dá)水平較初治時(shí)升高倍數(shù)間分別為(3.57±1.13)、(1.46±0.79)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩組間BCR-ABL與PTEN表達(dá)水平相關(guān)性分析，有效組r=3.174，P<0.01；無(wú)效組r=0.192，P>0.05，提示有效組中BCR-ABL與PTEN呈負(fù)相關(guān)。

圖1PTEN的Multicomponent Plot曲線

圖2PTEN mRNA的表達(dá)水平

3討論

Ph染色體是慢性粒細(xì)胞白血病遺傳學(xué)特征性表現(xiàn)[2-3]，9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上C-abl原癌基因易位至22號(hào)染色體長(zhǎng)臂的斷裂點(diǎn)集中區(qū)(BCR)，融合為BCR-ABL基因，其編碼的BCR-ABL蛋白具很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，能促使細(xì)胞過(guò)度增殖，且并不依賴細(xì)胞生長(zhǎng)因子的參與，還可抑制細(xì)胞的黏附及凋亡，從而引發(fā)異常細(xì)胞的大量惡性增殖[10]。隨著伊馬替尼進(jìn)入臨床后，CML的治療效果得到極大提高，伊馬替尼敏感患者6～7年存活率接近100%[11]。隨著治療效果的改善，科學(xué)界更多地關(guān)注關(guān)鍵分子的監(jiān)測(cè)，6個(gè)月BCR-ABL下降水平成為一個(gè)重要的預(yù)后判斷指標(biāo)[12]。

PTEN是一個(gè)高度保守的抑癌基因，其抑癌機(jī)制體現(xiàn)于多個(gè)方面。Peng等[13-14]發(fā)現(xiàn)CML小鼠的LSCs中PTEN表達(dá)被下調(diào)。通過(guò)敲除PTEN和過(guò)度表達(dá)兩種手段觀察，PTEN缺失情況下慢性粒細(xì)胞白血病小鼠疾病進(jìn)展加速，過(guò)度表達(dá)PTEN的小鼠疾病則進(jìn)展緩慢，故PTEN蛋白可能是慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)生、發(fā)展中一種重要的蛋白分子。

本試驗(yàn)旨在觀察BCR-ABL下降水平與PTEN在體內(nèi)表達(dá)之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示BCR-ABL被抑制后，PTEN mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，并與BCR-ABL抑制程度呈負(fù)相關(guān)。該結(jié)果與Morotti 等[8]和Zhou等[7]的結(jié)果類似，提示BCR-ABL可抑制PTEN水平，其機(jī)制可能與HAUSP有關(guān)，BCR-ABL介導(dǎo)HAUSP泛素化PTEN，促進(jìn)PTEN降解，從而抑制PTEN的表達(dá)。

綜上所述，BCR-ABL促進(jìn)腫瘤細(xì)胞大量增殖的機(jī)制可能與PTEN活性受抑相關(guān)，反之當(dāng)BCR-ABL被抑制后PTEN水平則隨之升高。PTEN水平上升與疾病對(duì)伊馬替尼敏感性有關(guān)，故PTEN的表達(dá)水平或許可作為一個(gè)預(yù)后因素，但需要擴(kuò)大樣本在蛋白水平上進(jìn)一步驗(yàn)證。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.041

(收稿日期：2016-01-21，修回日期：2016-03-11)