周茗萱，盧曼怡，管　蓉

(湖北大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430062)

固定化Cu2+螯合親和膜的制備及螯合性能研究

周茗萱，盧曼怡，管蓉*

(湖北大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430062)

摘要：以尼龍66(Nylon 66)膜為基膜，環(huán)氧氯丙烷(ECH)為活化劑，殼聚糖(CS)為交聯(lián)劑，亞胺基二乙酸(IDA)為螯合劑，Cu2+為配位基，制備了固定化Cu2+螯合親和膜(ICAM膜)，測量了其水通量和孔隙率，研究了IDA的濃度、偶聯(lián)溫度、CuSO4溶液的pH值和初始濃度以及螯合時(shí)間對親和膜螯合Cu2+量的影響，并討論了該膜螯合Cu2+的機(jī)理。結(jié)果表明：膜表面有大量孔洞，符合親和膜的要求；在一定范圍內(nèi)，較高的IDA濃度、較高的CuSO4溶液初始濃度和pH值、較長的螯合時(shí)間和較高的螯合溫度均有利于ICAM膜對Cu2+的螯合；Freundlich吸附等溫模型和準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型用于表征該膜對螯合Cu2+的行為具有較好的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：親和膜；制備；螯合Cu2+；影響因素

隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，對生物大分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸、酶、多糖、多肽等分離純化的要求也越來越高，傳統(tǒng)的分離提純方法很難達(dá)到應(yīng)用目的。固定化金屬離子親和膜是過去 30 年里發(fā)展起來的親和膜技術(shù)，借助分離膜滲透性好的優(yōu)點(diǎn)，可以在較低的操作壓和較高的流速下快速地分離和純化生物大分子[1]，其根本原理是膜與大分子之間配位鍵的形成與解離。由于蛋白質(zhì)表面的氨基酸類電子供體可與過渡金屬離子形成配位復(fù)合物[2]，對于分別螯合有Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+和Ni2+亞氨基二乙酸型親和膜來說，Cu2+-IDA對蛋白質(zhì)或氨基酸的親和力最強(qiáng)[3]，所以將Cu2+固定在親和膜上制成Cu2+螯合親和膜，可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離純化。目前，固定化金屬螯合親和膜所選用的基膜以纖維素和殼聚糖等天然高分子材料居多，但該類材料的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性較差，在實(shí)際應(yīng)用中并不理想。Nylon 66價(jià)廉易得、孔徑均勻、化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性能良好，但該膜缺乏活性官能團(tuán)，不滿足親和分離的需要。本文經(jīng)綜合考慮后，選擇Nylon 66作為基膜材料，并對其進(jìn)行一系列的改性，制備了固定化Cu2+螯合尼龍親和膜(Immobilized Cu2+-chelated Affinity Membrane, ICAM)，并研究了該膜對Cu2+的螯合行為和作用機(jī)理。

1實(shí)驗(yàn)

1.1主要儀器及原料

722N可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；JSM6510LV掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；尼龍66微孔濾膜，海寧市益博過濾器材廠；鹽酸、環(huán)氧氯丙烷、硫酸銅，均為A.R.級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖(B.R.)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞氨基二乙酸(B.R.)，南京都萊生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1固定化Cu2+螯合親和膜的制備

將Nylon 66膜用鹽酸水解后置于20%的ECH溶液中，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值為11，60 ℃水浴振蕩10 h后，再取適量的CS，用1%的CH3COOH溶液配成0.01 g/mL的CS溶液，室溫下與膜反應(yīng)1 h，清洗去除膜表面未反應(yīng)的CS，再用ECH進(jìn)行二次活化。稱取適量IDA，配成115 mg/mL的溶液，與二次活化膜反應(yīng)得到二次交聯(lián)膜，將二次交聯(lián)膜與CuSO4溶液室溫下反應(yīng)，即可得到固定化Cu2+螯合尼龍親和膜(ICAM膜)。

1.2.2膜性能測試

在0.5 MPa下收集一段時(shí)間內(nèi)透過ICAM膜的水的體積，按公式J=V/(A*t)計(jì)算水通量。式中：J為水通量(cm/min)，V為透過水的體積(mL)，A為有效膜面積(cm2)，t為透過時(shí)間(min)。

取一定面積的ICAM膜，測量其厚度，求出膜體積，在去離子水中浸泡72 h后取出，擦去水分后迅速稱重，濕膜質(zhì)量為W1，120 ℃下真空干燥至恒重，稱重得烘干后膜的質(zhì)量W2，由公式ε=(W1-W2)*100%/(V*dw)計(jì)算膜的孔隙率。式中：ε為孔隙率(%)，W1為濕膜的質(zhì)量(g)，W2為干膜的質(zhì)量(g)，V為膜的體積(cm3)，dw為水的密度(g/cm3)。

1.2.3螯合Cu2+量的影響因素

按文獻(xiàn)[4]的方法作Cu2+濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，研究IDA的濃度、偶聯(lián)溫度、CuSO4溶液的pH值、Cu2+初始濃度和螯合時(shí)間對ICAM膜螯合Cu2+量的影響。

1.3吸附等溫式

為了研究ICAM膜對Cu2+的螯合機(jī)理，本文使用Langmuir、Freundlich、D-R三種吸附等溫式來描述ICAM膜對Cu2+的螯合[5]。吸附條件：25 ℃，pH值為6.0，吸附時(shí)間2 h，CuSO4溶液的濃度為0.05～0.20 mg/mL。三種吸附等溫式如下：

① Langmuir吸附等溫式公式為：

1/qe=1/qm+Kd/(Ceqm)

(1)

② Freundlich吸附等溫式為：

lgqe=lgKF+(1/n)/lgCe

(2)

③ D-R吸附等溫式為：

lnqe=ln X′m - K′ε2

(3)

1.4吸附動(dòng)力學(xué)

將準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型分別用于研究Cu2+在ICAM膜上的吸附動(dòng)力學(xué)。吸附條件：25 ℃，pH值為6.0，吸附時(shí)間5～50 min，CuSO4溶液的濃度為0.20 mg/mL。兩種動(dòng)力學(xué)方程如下：

①準(zhǔn)一級動(dòng)力學(xué)方程表達(dá)式為:

ln(qe-q)=lnqe-k1t

(4)

②準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)方程表達(dá)式為:

(5)

式中：qe為理論平衡吸附量(mg/g)；q 為t時(shí)刻時(shí)ICAM膜對BSA的吸附量(mg/g)；t 為吸附時(shí)間(min)；k1為準(zhǔn)一級吸附速率常數(shù)(min-1)；k2為準(zhǔn)二級吸附速率常數(shù)(min-1)。

2結(jié)果與討論

2.1膜性能

計(jì)算得到ICAM膜的平均水通量為5.431 cm/min，平均孔隙率為56.85%，表明膜經(jīng)過一系列改性后形成了大量孔洞。

2.2BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1為Cu2+濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。在可見分光光度計(jì)上于760 nm處測量0.002 5～0.025 mol/L的CuSO4溶液的吸光度，作濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測量未知濃度CuSO4溶液的吸光度，通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計(jì)算出該溶液的濃度。

圖1　Cu2+濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3IDA濃度對Cu2+螯合量的影響

配置不同濃度的IDA溶液，將二次交聯(lián)膜分別放入溶液中，25 ℃水浴10 h。清洗干凈后將膜置于0.10 mol/L CuSO4溶液中(pH值為5.0)，25 ℃反應(yīng)2 h，計(jì)算膜上Cu2+螯合量。如圖2所示，膜上Cu2+的螯合量隨IDA濃度的增大而不斷增多，當(dāng)IDA濃度為115 mg/mL時(shí)，螯合量達(dá)到最大值；繼續(xù)增加IDA的濃度，Cu2+螯合量不再增多。這是由于經(jīng)過處理之后的Nylon 66膜上能與IDA反應(yīng)的基團(tuán)是有限的，IDA能與膜反應(yīng)的量也是有限的，因而膜上能螯合的Cu2+的量也最終達(dá)到飽和。

圖2　IDA濃度對Cu2+螯合量的影響

2.4偶聯(lián)溫度對Cu2+螯合量的影響

取適量115 mg/L的IDA溶液，放入二次活化膜，分別在不同的溫度下水浴反應(yīng)10 h，其他條件同2.3。如圖3所示，Cu2+螯合量隨反應(yīng)溫度的升高而不斷增多，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，Cu2+螯合量為16.097 mg/g；溫度繼續(xù)升高，Cu2+螯合量減少，故IDA與膜的反應(yīng)較優(yōu)溫度為50 ℃。

圖3　IDA偶聯(lián)溫度對Cu2+螯合量的影響

2.5CuSO4溶液pH值對Cu2+螯合量的影響

取適量115 mg/L的IDA溶液，50 ℃下與二次活化膜反應(yīng)，制得二次交聯(lián)膜，25 ℃下分別置于0.1 mol/L不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)的CuSO4溶液中2 h。由于Cu2+與OH-會反應(yīng)，故pH值最大為6.0。pH值對Cu2+螯合量的影響如圖4所示。

圖4　CuSO4溶液pH對Cu2+螯合量的影響

由圖4可知，Cu2+螯合量隨溶液pH的增加而增大，在pH值為6.0時(shí)，螯合量達(dá)到了最大。這是由于在pH值較低的溶液中，H+濃度較高，膜表面大量的正電荷產(chǎn)生了靜電排斥作用，降低了膜上Cu2+吸附量。當(dāng)pH值增加時(shí)，H+濃度降低，靜電排斥作用隨H+濃度減少而降低，膜上裸露出更多帶負(fù)電的Cu2+結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致Cu2+螯合量增多[5]。故螯合Cu2+的較優(yōu)pH值為6.0。

2.6Cu2+初始濃度對Cu2+螯合量的影響

取不同濃度的硫酸銅溶液，將二次活化膜放入溶液中，在25 ℃、pH值為6.0時(shí)吸附2 h。Cu2+濃度對Cu2+螯合量的影響見圖5。

圖5　Cu2+初始濃度對Cu2+螯合量的影響

由圖5可知，Cu2+在膜上的螯合量隨Cu2+初始濃度的增加而增大，并在Cu2+濃度為0.20 mg/mL時(shí)達(dá)到最大。這是由于高的Cu2+初始濃度提供了高的驅(qū)動(dòng)力來克服溶液和膜之間的傳質(zhì)阻力；而當(dāng)Cu2+濃度進(jìn)一步增大時(shí)，螯合量不再變化，這是因?yàn)槟ど吓cCu2+結(jié)合的活性位點(diǎn)是有限的。

2.7螯合時(shí)間對Cu2+螯合量的影響

取pH值為6.0、濃度0.20 mg/mL的CuSO4溶液在25 ℃下用二次交聯(lián)膜吸附，每隔一段時(shí)間取一次樣，計(jì)算膜上吸附Cu2+的量，螯合時(shí)間對吸附量的影響如圖6所示。由圖6可知，Cu2+的吸附十分迅速，在40 min時(shí)達(dá)到最大，此后螯合量基本不變。因此，最優(yōu)螯合時(shí)間為40 min。

圖6　螯合時(shí)間對Cu2+螯合量的影響

2.8吸附等溫式

按照公式(1)、(2)和(3)，分別以1/qe對1/Ce作圖、以lgqe對lgCe作圖和以lnqe對ε2作圖，得到Langmuir吸附等溫線、Freundlich吸附等溫線和D-R吸附等溫線，如圖7中a、b、c所示，對三種吸附等溫式進(jìn)行比較，以此來分析ICAM膜對Cu2+的螯合機(jī)理。

由圖7可知，F(xiàn)reundlich吸附等溫式的線性相關(guān)系數(shù)更接近1，表明Cu2+在二次交聯(lián)膜上的螯合更符合Freundlich吸附等溫行為。

圖7　三種吸附等溫線

2.9吸附動(dòng)力學(xué)

按照公式(4)、(5)，分別以ln(qe-q)對t作圖，以t/q對t作圖，得到準(zhǔn)一級動(dòng)力學(xué)模型和準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型，如圖8中a、b所示。

對比兩種動(dòng)力學(xué)模型，準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)R2比準(zhǔn)一級動(dòng)力學(xué)模型更接近1，且理論吸附量qe更接近實(shí)驗(yàn)值，表明本吸附體系的動(dòng)力學(xué)分析更適合準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型。

圖8　準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型

3結(jié)論

本文制備的ICAM膜具有大量均勻孔洞和較大的比表面積，符合ICAM膜的要求。在一定范圍內(nèi)，隨著IDA的濃度、CuSO4溶液初始濃度、pH值、螯合時(shí)間和螯合溫度的增加，ICAM膜對Cu2+的螯合量增加；Freundlich吸附等溫模型和準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型用于表征該膜對Cu2+的螯合具有較好的相關(guān)性。

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(責(zé)任編輯：張凱兵)

Research on Preparation and Chelation Property of Immobilized Cu2+-Chelated Affinity Membrane

Zhou Mingxuan, Lu Manyi, Guan Rong*

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,HubeiUniversity,Wuhan,Hubei430062,China)

Abstract：An immobilized Cu2+chelated affinity membrane was prepared by using Nylon 66 membrane as substrate membrane, epichlorohydrin(ECH) as activating agent, chitosan(CS) as crosslinker, iminodiacetic acid(IDA) as coupling agent and copper ion as immobilized metal ion. The porosity and water flux of immobilized Cu2+chelated affinity membrane was investigated, and then the effects of the concentration of IDA, coupling temperature, pH value and initial concentration of CuSO4 solution, and the chelating time of the chelation were also examined. In addition, the chelation mechanism of Cu2+was discussed. The results showed that there were a large number of uniform holes in the immobilized Cu2+chelated affinity membrane, which indicated that the prepared membrane could meet the requirements of the affinity membrane. Besides, the high concentration of IDA, the coupling temperature, the pH value, the initial concentration of CuSO4 solution and long chelation time were all favorable to chelate Cu2+in a certain range. The Freundlich isotherm could describe the chelation behavior of Cu2+and the pseudo-second-order kinetic model could provide the better correlation for the experimental results.

Key Words：affinity membrane; preparation; Cu2+chelated; influence factors

收稿日期：2016-03-02

作者簡介：周茗萱(1993-)，女，湖北孝感人，湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院碩士研究生。

中圖分類號：TQ028.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-4824(2016)03-0005-05

盧曼怡(1990-)，女，湖北宜昌人，湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院碩士研究生。

管蓉(1956-)，女，四川宜賓人，湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院教授，本文通信作者。