王加平，朱繼平，孟曉波，梅　燕，秦文敬

(江蘇省連云港市東?？h人民醫(yī)院檢驗科　222300)

·論著·

重癥肌無力患者外周血單個核細胞中KLF4、RORγt與miR-206水平變化的臨床意義

王加平，朱繼平，孟曉波，梅燕，秦文敬

(江蘇省連云港市東海縣人民醫(yī)院檢驗科222300)

摘要:目的檢測重癥肌無力患者外周血單個核細胞(PBMC)中鋅指樣轉錄因子4(KLF4)、孤兒核受體γt(RORγt)、microRNA-206的表達水平，探討它們在重癥肌無力患者發(fā)病中的作用。方法采集重癥肌無力患者及健康對照者清晨空腹外周血標本，梯度離心得到人PBMC。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測PBMC中KLF4、RORγt mRNA、microRNA-206的相對表達量。結果重癥肌無力患者PBMC中KLF4 mRNA為0.594±0.181，健康對照者為0.089±0.025；重癥肌無力患者PBMC中RORγt mRNA表達水平為0.570±0.266，健康對照者為0.067±0.016,重癥肌無力患者均顯著高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。重癥肌無力患者PBMC中microRNA-206表達水平為0.053±0.018，健康對照者為0.134±0.056，重癥肌無力患者顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。重癥肌無力患者PBMC中KLF4、RORγt相對表達量與microRNA-206表達水平均呈負相關(r=-0.675，P<0.05,r=-0.806，P<0.05)。結論重癥肌無力患者PBMC 中KLF4mRNA、RORγtmRNA的表達水平增高及microRNA-206表達水平下降，和疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切的關系。

關鍵詞:重癥肌無力；單個核細胞；鋅指樣轉錄因子4；孤兒核受體γt；microRNA-206

重癥肌無力(MG) 是一種以胸腺為靶器官的自身免疫性疾病[1]。有研究表明，輔助性T細胞17(Th17)參與MG的發(fā)病，Th17是近年來新命名的一類輔助性CD4+T細胞亞群，其具有獨特的分化途徑和轉錄因子(RORγt)，以能夠誘導編碼白細胞介素-17(IL-17)的下游基因表達為主要特征[2-3]。鋅指樣轉錄因子4(KLF4)是一種含鋅指修飾結構的蛋白，是Th17分化的正調節(jié)因子[4-5]。MicroRNA(miRNA) 是一類短的非編碼RNA，大約20～22個核苷酸，介導RNA干擾并且在翻譯水平抑制蛋白表達。已經(jīng)證實人類KLF4是miR-206的靶分子之一[6]。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR) 檢測MG患者人外周血單個核細胞(PBMC)中KLF4、RORγt mRNA和miR-206的表達水平，并分析KLF4、RORγt 與miR-206表達的相關性，探討這幾個因素在MG發(fā)病中的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2012年1月至2015年6月在本院經(jīng)臨床確診的MG患者27例，選擇的MG病例根據(jù)典型的臨床癥狀、新斯的明試驗陽性或神經(jīng)重復電刺激遞減試驗陽性確診[7],其中男16例，女11例，平均年齡(49±14)歲；健康對照組選擇本院體檢中心健康體檢者20例，其中男13例，女7例，平均年齡(51±9)歲，均無近期感染或自身免疫病史。兩組研究對象之間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑實時熒光PCR儀為美國伯樂CFX 96型，F(xiàn)icoll-Hypaque人淋巴細胞分離液從天津灝陽生物制品有限公司采購,淋巴細胞刺激劑佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)從Sigma公司采購。上海生工合成PCR引物、Trizaol和SYBR Green購自Invitrogen公司。

1.3方法

1.3.1標本處理清晨采取研究對象空腹靜脈血3～5 mL，肝素鈉抗凝，采用Ficoll-Hypaque人淋巴細胞分離液梯度離心獲得人PBMC，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,將細胞數(shù)調整為1×106/mL，加入24孔細胞培養(yǎng)板,放置在含有PMA(50 ng/mL)和Ionomycin (1.0 μg/mL)RPMI-1640的培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和溫度條件下溫育5 h后，收集細胞。

1.3.2樣本中KLF4、RORγt mRNA及miR-206相對表達量檢測從將PBMCs刺激5 h后收集的細胞中提取總mRNA。按照TOYOBO試劑盒說明書反轉錄成cDNA。新合成的cDNA置于-20 ℃冰箱中備用。采用CFX 96實時熒光PCR儀按照Bio-Rad SYBR Green Super Mix 說明書進行檢測。所用引物序列為：KLF4上游引物為5′-CAA GTC CCG CCGCTC CAT TAC CAA-3′，下游引物為5′-CCA CAG CCG TCC CAG TCA CAG TGG-3′；RORγt上游引物為5′-CCT GGG CTC CTC GCC TGA CC-3′，下游引物為 5′-TCT CTC TGC CCT CAG CC TTG CC-3′；β-actin上游引物為5′-CAC GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3′，下游引物為5′-CAT ACT CCT GCT TGC TGA TC-3′，以β-actin為參照進行校準；miR-206上游引物為5′-GAG TGC TGG AAT GTA AGG AAG-3′，下游引物為5′-GCA GGG TCC GAG GTA TTC-3′，以small nuclear-RNA即snRNA為參照。每份標本同時采用相同反應體系和條件進行檢測，PCR擴增3次。

2結果

2.1MG患者與健康對照組PBMC 中KLF4、RORγt mRNA及miR-206表達水平比較見表1。MG患者PBMC 中KLF4 和RORγt mRNA相對表達量顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.563、7.552,P<0.05)，miR-206相對表達量顯著低于健康對照組，差異也有統(tǒng)計學意義(t=2.579,P<0.05)。

表1　　兩組PBMC 中KLF4 mRNA、RORγt mRNA和

注：與健康對照組比較，*P<0.05。

2.2MG患者PBMC 中KLF4和RORγt相關性分析見圖1。對MG患者PBMC 中KLF4和RORγt mRNA相對表達量的相關性采用直線相關分析，圖1顯示KLF4與RORγt之間呈正相關(r= 0.705，P<0.05)。

圖1　MG患者PBMC 中KLF4和RORγt mRNA

2.3MG患者PBMC 中KLF4、RORγt與miR-206的相關性分析見圖2、3。采用直線相關分析MG患者PBMC 中KLF4和RORγt mRNA分別與miR-206相對表達量的相關性，圖2、3結果顯示，KLF4和RORγt mRNA與miR-206的表達水平之間均呈負相關(r=-0.675、-0.806，P<0.05)。

圖2　MG患者PBMC中KLF4與miR-206

圖3　MG患者PBMC 中RORγt mRNA與miR-206

3討論

MG是一種自身免疫性疾病，以T細胞輔助、抗體介導、補體參與的神經(jīng)肌肉接頭傳遞障礙為特征，有研究結果表明，免疫調節(jié)細胞參與MG誘導和發(fā)病過程[1]。Th17是一類與Th1和Th2不同的CD4+T細胞新亞群,這類細胞主要以分泌IL-17而得名[7-8]。RORγt是Th17特異性的主要轉錄因子,調控IL-17的分泌[2]。有研究表明，Th17細胞數(shù)目上調可導致免疫耐受失衡，引發(fā)MG等自身免疫性疾病發(fā)病[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，MG患者外周血Th17特異性轉錄因子RORγt的表達呈顯著性增高，由此提示Th17與MG的發(fā)生和發(fā)展密切相關。

KLF家族是真核生物中一大類基礎轉錄因子，在真核細胞的基因轉錄調控過程中起重要作用[9]。KLF4是其家族中目前研究最多的一員，包含3個結構域:高度保守的C-端DNA結合結構域、高度可變的N-端轉錄調節(jié)結構域及核定位序列[10]。KLF4能結合靶基因富含Gc的啟動子序列，促進或抑制下游基因表達，KLF4對Th17的分化具有正調節(jié)作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，在MG患者PBMC中KLF4 mRNA的表達也顯著增高，而且與RORγt mRNA的表達呈正相關(r=0.705，P<0.05)。本研究結果提示，MG患者PBMC中KLF4 mRNA可以通過促進RORγt活性進而上調Th17表達，促進Th17細胞分化。

miRNA是一類內源性的具有調控功能的非編碼小分子RNA，每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調節(jié)同一個基因。它通過與靶基因的3′UTR結合繼而抑制靶基因的表達[11]。人類的外周血中KLF4是miR-206的靶分子之一[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，MG患者PBMC中miR-206表達下降，相反KLF4 mRNA表達水平卻呈升高狀態(tài)，二者呈明顯負相關(r=-0.675，P<0.05)，并且miR-206與RORγt mRNA表達也表現(xiàn)出顯著負相關(r=-0.806，P<0.05)，這可能是由于miR-206的低表達從而上調了KLF4 mRNA的表達，進而促進RORγt mRNA的高表達，從而使MG患者PBMC中Th17比例增高。

本研究結果表明，MG患者PBMC中miR-206的表達下降可在一定程度使KLF4 mRNA表達上調，進一步促使RORγt mRNA表達增強，最終提高了Th17水平，促進疾病的發(fā)生和發(fā)展，相關的分子機制還需進一步研究。

參考文獻

[1]Meriggioli MN,Sanders DB.Autoimmune myasthenia gravis:emerging clinical and biological heterogeneity[J].Lancet Neurol,2009,8(5):475-490.

[2]王中魁,魏東寧,王衛(wèi)，等.Th17細胞與重癥肌無力發(fā)病及臨床嚴重度相關性研究[J].中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志,2013,20(3):167-171.

[3]Weaver CT,Hatton RD,Mangan PR,et al.IL-17 family cytokines and the expanding diversity of effectorT cell lineages[J].Ann Rev Immunol,2007,25(5):821-852.

[4]Lebson L,Gocke A,Rosenzweig J,et al.Cutting edge:the transcription factor Kruppel-like factor 4 regulates the differentiation of Th17 cells independently of RORγt [J].J Immunol,2010,185(12):7161-7164.

[5]An J,Golech S,Klaewsongkram J,et al.Kruppel-like factor 4 (KLF4)directly regulates proliferation in thymocyte development and IL-17 expression during Th17 differentiation [J].FASEB J,2011,25(10):3634-3645.

[6]Parasramka MA,Dashwood WM,Wang R,et al.A.role for low-abundance miRNAs in colon cancer:the miR-206/Kruppel-like factor 4 (KLF4) axis [J].Clin Epigenetics,2012,4(1):16-26.

[7]Pal J,Rozsa C,Komoly S,et al．Clinical and biological heterogeneity of autoimmune myasthenia gravis[J]．J Neuroimmunol,2011,231(1/2):43-54.

[8]彭素芳，王建軍，陳建國，等.胃癌患者外周血單個核細胞RORγt 和IL-17 mRNA水平的檢測及臨床意義[J].免疫學雜志，2009,25(3):318-321.

[9]Yang HW,Xia T,Chen ZL,et al.Cloning,chromosomallocalization and expression patterns of porcine Krüppel-like factors 4,-5,-7 and the early growth response factor 2[J].Biotechnol Lett,2007,29(1):157-163.

[10]Pearson R，F(xiàn)leetwood J，Eaton S，et al． Kruppel-like transcription factors:a functional family[J].Int J Biochem Cell Biol，2008，40(10):1996-2001．

[11]Stefani G,Slack FJ.Small non-coding RNAs in animal development [J].Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9(3):219-230.

The significance of the levels of KLF4,RORγt,microRNA-206 in peripheralblood mononuclear cells of patients with myasthenia gravis

WANGJiaping,ZHUJiping,MENGXiaobo,MEIYan,QINWenjing

(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofDonghaiCounty,Lianyungang,Jiangsu222300,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the expression levels of Kruppel-like factor 4 (KLF4),orphan nuclear receptor gamma t (RORγt) and microRNA-206 (miR-206) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with myasthenia gravis(MG) and to explore the effects of these indicators on the pathogenesis of MG.MethodsFasting blood samples from patients with MG and healthy controls were collected in the morning.PBMCs were isolated by standard density-gradient centrifugation over Ficoll-Hypaque solution in all the subjects.The expression levels of KLF4,RORγt mRNA and microRNA-206 were extracted from PBMCs which were stimulated by phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) and ionomycin,and then the mRNAs was transcribed reversely into cDNA.The expression levels of KLF4,RORγt mRNA and microRNA-206 were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR).ResultsThe level of KLF4 in the patients with MG 0.594±0.181 was significantly higher than that of healthy controls 0.089±0.025(P<0.05) and the level of RORγt in the patients with MG 0.570±0.266 was also significantly higher than that of healthy controls 0.067±0.016(P<0.05).The expression level of miR-206 in the patients of MG 0.053±0.018 was significantly lower than that of the healthy controls 0.134±0.056(P<0.05).In addition,the expression levels of KLF4 (r=-0.675,P<0.05) and RORγt (r=-0.806,P<0.05) were negatively correlated with the level of miR-206 in MG patients.Conclusion The increased expression levels of KLF4 and RORγt and decreased expression level of miR-206 may be closely correlated with the occurrence and development of MG.

Key words:myasthenia gravis;mononuclear cells;kruppel-like factor 4;RORγt;microRNA-206

作者簡介：王加平，女，副主任技師，主要從事臨床免疫檢驗研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.020

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1500-03

(收稿日期：2016-01-13修回日期：2016-03-29)