姜月紅，王燕穎.黑龍江省醫(yī)院檢驗科，黑龍江哈爾濱　50036；.上海市東方醫(yī)院消化內科，上?！?00

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藥物性肝病患者髓過氧化物酶基因多態(tài)性分析

姜月紅1，王燕穎2
1.黑龍江省醫(yī)院檢驗科，黑龍江哈爾濱150036；2.上海市東方醫(yī)院消化內科，上海200120

［摘要］目的探討髓過氧化物酶（MPO）基因多態(tài)性與藥物性肝?。―ILI）之間的關系。方法病例采用對照分析的方法，方便收集37例藥物性肝病患者和30例健康對照者外周血標本，提取DNA進行MPO-463G/A多態(tài)性檢測。結果MP0-463 GG、GA和AA 3種基因型的頻率在DILI組中分別為86.5％、10.8％和2.7％，在對照組中分別為73.4％、23.3％和3.3％；將攜帶MP0-463 GA和AA型者合并后與攜帶MPO-463 GG型相比較，患DILI的風險顯著增高，相對于G等位基因，攜帶A等位基因的個體患DILI的風險顯著降低，說明MP0-463 G/A多態(tài)性與DILI的發(fā)生有關。結論髓過氧化物酶基因多態(tài)性與藥物性肝病易感性之間存在相關性，值得進一步研究。

［關鍵詞］藥物性肝病；髓過氧化物酶；基因多態(tài)性

藥物性肝病（Drug-induced liver disease，DILI）是指由于臨床治療、營養(yǎng)或藥物濫用所引起的肝細胞損傷性疾病，其發(fā)病機制復雜，主要與藥物、個體差異和藥物與機體的相互作用等方面相關，近幾年關于診斷DILI沒有特異性的診斷標準［1］。髓過氧化物酶（Myeloperoxidase MPO）是中性粒細胞嗜天青顆粒產生的氧化應激相關酶，能催化產生次氯酸能引起宿主DNA損傷［2］，MPO的基因具有多態(tài)性，不同基因型的個體MPO基因表達水平不同，導致個體對外源性物質易感性的差異，流行病學研究表明髓過氧化物酶（MPO）463G/A多態(tài)性與多種疾病相關。目前已在多種炎癥和惡性腫瘤中觀察到了MPO-463G/A基因多態(tài)性的作用，例如冠心病、大腸癌等疾病的易感性都與MPO-463G/A基因的多態(tài)性有關。該研究應用聚合酶鏈反應—限制片段長度多態(tài)性（PCR—RFLP）技術，對DILI患者與常規(guī)查體者進行基因檢測及相關檢查，采用病例—對照分析，旨在研究MPO基因多態(tài)性與DILI易感性之間的關系，為DILI的早期診斷和預防提供新的方法，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

方便選擇2009年9月—2011年9月黑龍江省醫(yī)院消化內科與傳染科及健康體檢者作為研究對象，分為DILI組、健康對照組。DILI組：37例，男11例，女26例，年齡25～68歲，平均（40.51±8.21）歲；研究入選標準［3］：①入組患者用藥后，同時在1～4周內發(fā)生肝損害；②患者伴有皮疹、發(fā)熱、瘙癢等過敏反應現象；③經檢測末梢血嗜酸性粒細胞的水平＞0.06；④患者在臨床上出現有肝內淤膽或者肝細胞損害的特征與病理變化；⑤MIT或者藥物淋巴細胞轉化實驗結果呈陽性；⑥檢測病毒性肝炎結果為陰性；⑦患者伴有藥源性肝損害的病史，同時若是應用相同的藥物可復發(fā)。

健康對照組：30例，其中男9例，女21例；年齡23～63歲，平均（41.23±9.01）歲，所有對象均無心、肝、肺等器官疾患，肝功能檢測無異常。以上兩組資料得到患者的同意，并通過倫理委員會的批準。在性別年齡構成差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2儀器和試劑

Tap DNA聚合酶購自日本Takara公司；限制性核酸內切酶A ci l購自美國NEB公司；PCR引物由上海博亞生物公司合成；凝膠圖象掃描儀、Gene Amp 2400 PCR儀（美國ABI公司）。

1.3MPO基因多態(tài)性檢測

1.3.1DNA提取1 mL新鮮血液離心去掉上層血漿后，加入紅細胞裂解液至紅細胞溶血完全，將離心沉淀后的懸液添加150 μL Solution I，應用旋渦混勻器震蕩將其搖勻，時間約為10～25 s，保存在恒溫65℃的條件下，約30 min。在向其加入約300 μL的Solution II進行混勻，同樣在65℃條件下保存，離心后去上清液。并在上清液中加入250 μL無水乙醇。然后取得的溶液進行離心吸附柱，向其中加入500 μL的Solution III，進行離心后，棄用柱液。再向其中添加Eppendorf15 000 rpm于管中，同時進行離心，約3 min，且收集管。將所得的離心吸附柱放在一個1.5 mL的離心管中，再次殺菌，且加入60 μL EluteSolution，65℃孵育3 min，溫度控制在65℃的左右，最后應用15 000 rpm離心，時間為1 min，把所收集的DNA保存在-20℃的冰箱中。

1.3.2PCR擴增依據NCBI GeneBank資料：MPO基因長11kb，位于17q23-q24，其中包含內含子11個、外顯子12個，基因庫注冊號為M19508。PCR產物為350bp。擴增喊MPOG=463基因的PCR引物為下游5'-GCA ATG GTT CAA GCG ATT CTT C-3'及上游5'-CGG TAT AGG CAC ACA ATG GTG AG-3'。每25 μL PCR反應液中包含模板DNA100 μg，各種引物0.4 μmol/L、dNTP0.2 mmol/L，1.5 mmol/L MgCL21.0U以及Taq聚合酶、反應緩沖液等。于Gene Amp 2400PCR儀器中進行反應，反應條件為95℃變性2 min，94.2℃30 s，63.6℃30 s，72℃45 s，持續(xù)35個循環(huán)后溫度降至72℃持續(xù)8 min。取5 μL PCR置入％瓊脂糖凝膠中進行電泳分析，測定PCR產量。

1.3.3RFLP分析應用限制性內切酶Aci I分析MPO基因-463位點多態(tài)性反應體系如下：Buffer緩沖液2 μL，PCR產物8 μL，無菌去離子水9.5 μL，Aci I酶0.5 μL，總體積為20 μL。將上述各物質混勻后置于恒溫水浴（37℃）中16 h左右。用2 μL Loading Buffer與上述酶切產物混勻，點于含0.5 g/mL EB的3.0％瓊脂糖凝膠點樣孔中電泳，于凝膠成像系統下進行觀察并將實驗結果拍照記錄。

1.4統計方法

采用SPSS20.0軟件統計進行分析研究，等位基因頻率與組間基因型頻率的資料對比應用Χ2檢驗、相對危險度分析、Logistic回歸分析MP0基因463位點不同基因型在兩組人群構成比以OR值和95％CI表示DILI發(fā)生危險性。

2　結果

如表1所示，以MPO-463位點GG型純合子基因型為對照，攜帶MPO-463 GA型和單獨攜帶MPO-463AA型在DILI組與對照組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。將攜帶MP0-463GA型和攜帶MP0-463AA型合并后與攜帶MP0-463GG型比較，兩組結果差異具有統計學意義（P＜0.05），同時兩組檢測到的G/A等位基因頻率差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1　MPO基因分布與DILI的關系［n（％）］

3　討論

DILI是一種自身免疫性疾病，多是藥物和蛋白的共價結合形成免疫原性結合物（代謝產物和生物活性物質）［4］，通過抗原攝取、處理，而引起細胞增殖表達使機體肝臟受損，許多細胞因子也參與了反應。一般來講，DILI是主要的誘導因素為藥物不斷的轉化過程中多形成代謝物，而這些代謝產物一般都是細胞內部的較大分子物質，比如脂質、蛋白質等成分，它能夠促使DNA破壞、脂質膜過氧化、蛋白功能紊亂等。一般多數病人停藥后能夠恢復，使得組織和臨床上會發(fā)生相應的改變。有關數據表示［5］，由于國內外新藥的不斷使用，DILI發(fā)病率逐漸上升。目前，使用的髓過氧化物酶（MPO）屬于一種介導的白細胞酶，MPO能夠分泌反應性物質，從而作用影響機體自身的免疫功能，在生理狀況下，可以很好的催化過氧化氫與氯離子進行反應，進而生成生成次氯酸。相關研究表示［6］，機體內的多種自由基會與其反應從而殺死病原微生物，因此，MPO可以參體內的免疫反應，同時改善機體的免疫系統使其發(fā)生作用。若是機體處于氧化應激或者炎癥的時候，其催化所產生的物質會超過機體的抵抗呢你，成為負荷物質，進而會引起多種的組織損傷。MPO能夠氧化巰基，致使細胞中的色素及血紅蛋白失取活性，蛋白質進而降解，因此會很大程度的損傷肝細胞。而白細胞經過黏附、趨化、等作用在肝實質內被活化而滲出了血管壁，通過脫顆粒等一些物質刺激多種介質損傷血管內皮細胞和肺泡上皮細胞。

有關研究顯示［7］，MPO作為一種氧化應激的的酶類，主要用于衡量機體組織氧化和代謝的指標。人工的MPO在加工的過程中，其基因位于染色體的17q23-q24上，主要有11個內含子和12個外顯子構成［8］，Alu激素使其中一個SP-1轉錄結合位點的喪失，從而造成編碼區(qū)上游463位點G突變A。該實驗結果顯示MP0-463 GG、GA和AA 3種基因型的頻率在DILI組中分別為86.5％、10.8％和2.7％，在對照組中分別為73.4％、23.3％和3.3％，其中MP0-463GA型和攜帶MP0-463AA型合并后與攜帶MP0-463 GG型比較，兩組結果差異有統計學意義（P＜0.05），同時兩組檢測到的G/A等位基因頻率差異有統計學意義（P＜0.05）。說明MPO與DILI存在某種相關性，同時MPO也屬于血紅素輔基的血紅素蛋白酶，作為細胞的氧化感受器，MPO的基因一般多數是以其他形態(tài)存在的，可以影響機體對疾病的敏感特異性。因此，MPO基因多態(tài)性與DILI易感性是呈現關聯的關系。

綜上所述，髓過氧化物酶基因多態(tài)性與藥物性肝病易感性之間存在相關性，能夠為臨床方面的研究提供有價值的資料，也值得更進一步的研究。

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Analysis of Myeloperoxidase Gene Polymorphism in Patients with Drug-induced Liver Disease

JIANG Yue-hong1，WANG Yan-ying2
1.Department of Clinical Laboratory，Heilongjiang Provincial Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150036 China；2.Department of Gastroenterology，Shanghai East Hospital，Shanghai，200120 China

［Abstract］Objective To discuss the correlation between the myeloperoxidase gene polymorphism and drug-induced liver disease. Methods The peripheral blood samples of 37 cases of patients with drug-induced liver disease and 30 healthy control people were collected according to the case control analysis method，and the MPO-463G/A polymorphism detection was carried out by extracting DNA. Results The genotype frequency of MP0-463 GG，GA and AA was respectively 86.5％，10.8％and 2.7％in the DILI group and 73.4％，23.3％and 3.3％in the control group；the risk of suffering from DILI in patients with MP0-463 GA and AA obviously increased compared with that of the patients with MPO-463 GG，the risk of suffering from DILI of individuals with A allele obviously decreased compared with that of the individuals with G allele，which indicated that MP0-463 G/A polymorphism was correlated with the occurrence of the DILI. Conclusion Myeloperoxidase gene polymorphism has a correlation with the susceptibility of drug-induced liver disease，which is worth further research.

［Key words］Drug-induced liver disease；Myeloperoxidase；Gene polymorphism

［中圖分類號］R322.4+7

［文獻標識碼］A

［文章編號］1674-0742（2016）05（b）-0079-02

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.14.079

收稿日期：（2016-02-12）