■高　欣　藺　娜

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RFLP技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用與展望

■高欣藺娜

內(nèi)容摘要：分子標(biāo)記技術(shù)（簡稱MAS）已在人類、動物、植物以及微生物中得到了廣泛應(yīng)用，在眾多的MAS技術(shù)中，RFLP是最早也是應(yīng)用最為廣泛的一種分子標(biāo)記。為了更深入的了解RFLP技術(shù)及其發(fā)展方向，對德溫特世界專利索引數(shù)據(jù)庫（DWPI）中涉及利用該技術(shù)進(jìn)行植物育種的相關(guān)專利進(jìn)行了分析和研究，梳理了該技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)以及研究現(xiàn)狀，對于該技術(shù)未來的發(fā)展前景和展望，還有待于進(jìn)一步的深入研究和分析。

關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記RFLP專利分析

分子標(biāo)記技術(shù)（簡稱MAS）誕生于20世紀(jì)80年代，目前已在人類、動物、植物以及微生物中得到了廣泛應(yīng)用。相較于林、漁、牧業(yè)，MAS在作物領(lǐng)域的應(yīng)用更加廣泛，研究者們引入了大量的資源用于發(fā)展分子標(biāo)記圖譜以及尋找分子標(biāo)記與表現(xiàn)型之間關(guān)聯(lián)性的研究。

在眾多的MAS技術(shù)中，RFLP是最早也是應(yīng)用最為廣泛的一種分子標(biāo)記。目前，其廣泛用于植物連鎖圖的構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀基因的分子標(biāo)記等。其原理是基于植物基因組DNA上的堿基經(jīng)替換、插入、缺失或重復(fù)等，造成某種限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)的增加或喪失，從而產(chǎn)生限制性片段長度的多態(tài)性。對每一個DNA/酶組合而言，所產(chǎn)生的片段是特異性的，它可作為某一DNA所特有的“指紋”。其具有共顯性的特點(diǎn)，適于構(gòu)建植物遺傳圖譜。其不足之處在于分析過程比較繁瑣和花費(fèi)昂貴，不能用于大批量雜交種的純度鑒定；且RFLP必須經(jīng)過Southern雜交，費(fèi)時費(fèi)力，對DNA多態(tài)檢出的靈敏度不高。

為了更深入的了解RFLP技術(shù)及其發(fā)展方向，本文對德溫特世界專利索引數(shù)據(jù)庫（DWPI）中涉及利用該技術(shù)進(jìn)行植物育種的相關(guān)專利進(jìn)行了分析和研究。檢索截止日期為2015年12月 31日，樣本數(shù)量為800篇專利文獻(xiàn)。

RFLP技術(shù)的發(fā)展

從圖1中可以看出，RFLP作為第一代分子標(biāo)記技術(shù)在很長一段時期內(nèi)（1989-2002年）占有絕對的統(tǒng)治地位，1999年到達(dá)頂峰后申請量開始大幅下滑，在2007年小幅上漲后繼續(xù)呈下降態(tài)勢，直到近兩年申請量已經(jīng)以個位數(shù)計(jì)，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生與RFLP技術(shù)本身的特點(diǎn)是分不開的。RFLP作為Botstein等于1980年提出的分子生物學(xué)最早的遺傳標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記的數(shù)目多且穩(wěn)定，可用于構(gòu)建高密度的遺傳圖譜。但是，由于其分析過程比較繁瑣和花費(fèi)昂貴，費(fèi)時費(fèi)力，對DNA多態(tài)檢出的靈敏度不高等原因，逐漸被研究人員所摒棄，其主導(dǎo)地位被之后發(fā)展起來的第二、三代分子標(biāo)記技術(shù)所取代。

主要申請國及進(jìn)入國

某一國家專利技術(shù)申請量的多寡從一定程度上代表了該國技術(shù)的發(fā)展水平，而專利申請的進(jìn)入國家則代表了申請人對于專利技術(shù)的布局戰(zhàn)略，這對于企業(yè)的國際化發(fā)展是非常重要的。因此，下面對RFLP專利技術(shù)的主要提出國和申請目標(biāo)國進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)。

從圖2和圖3的申請量統(tǒng)計(jì)可見，在RFLP育種技術(shù)領(lǐng)域中，專利申請量最大的是美國，其次是日本、中國等，而這些主要的申請?zhí)岢鰢诔緡馄渌鲊膶＠季指饔袀?cè)重。如圖3所示，橫坐標(biāo)代表提出申請的國家，不同顏色的柱形代表其進(jìn)入的申請目標(biāo)國家。美國除了在本國提出專利保護(hù)申請之外，在其他上百個國家也提出了申請，包括澳大利亞、加拿大、中國、日本等國家，并且其中有相當(dāng)比例的申請是通過PCT途徑和EPO途徑提出的?？梢?，美國對其RFLP育種技術(shù)在很多國家進(jìn)行了專利布局（很多申請量較小的國家沒有在圖上標(biāo)出），這也體現(xiàn)了美國對全球生物資源的一種“圈地運(yùn)動”。

日本對RFLP育種技術(shù)提出的申請也進(jìn)入了幾十個國家，但主要是全球一些主要的農(nóng)業(yè)國家，在其他比較小的國家布局較少，應(yīng)該說側(cè)重點(diǎn)更強(qiáng)一些。與美國布局特點(diǎn)一致的是，日本的布局重點(diǎn)是美國、歐洲地區(qū)、中國和澳大利亞等國。

與上述技術(shù)發(fā)達(dá)國家形成鮮明對比的是，中國僅在少數(shù)國家進(jìn)行了布局，申請數(shù)量也較少，這種形勢對于我國種子企業(yè)的國際化顯然非常不利。當(dāng)然其中存在客觀原因，例如向國外提交專利申請并獲得保護(hù)的費(fèi)用不菲，對于我國大多數(shù)中小種子企業(yè)來說是很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但是，對于有能力在國外進(jìn)行專利布局的大型企業(yè)來說，有必要借鑒國外大企業(yè)的布局模式，將自己的專利技術(shù)有目的地布局到全球主要農(nóng)業(yè)國家或者目標(biāo)市場國中，為向國際化跨國公司發(fā)展開拓道路。

主要申請人

從RFLP育種技術(shù)專利的主要申請人來看，杜邦（先鋒）、迪卡（1998年被孟山都收購）、斯泰這三家排名前三位的公司，這說明了RFLP標(biāo)記輔助育種技術(shù)目前主要掌握在這三家公司手里（圖4）。

圖1　歷年RFLP技術(shù)專利申請量

圖2　RFLP技術(shù)專利各國申請量分布

圖3　RFLP技術(shù)專利在各國申請的國家分布

圖4　RFLP技術(shù)主要申請人分布

杜邦公司成立于1802年，是目前世界500強(qiáng)企業(yè)中成立時間最早、資格最老的常青樹。2011年，公司研發(fā)投入為20億美元，擁有9500多名科學(xué)家和技術(shù)人員以及全球超過150家研發(fā)機(jī)構(gòu)。目前，杜邦公司在全世界擁有21000多項(xiàng)有效專利以及超過15000項(xiàng)專利應(yīng)用。在超過200年的公司歷史中，憑借其雄厚的資本、先進(jìn)的經(jīng)營理念、貫徹始終的創(chuàng)新精神和不斷擴(kuò)展新領(lǐng)域的勇氣，杜邦公司創(chuàng)造了屬于自己的不敗奇跡。農(nóng)業(yè)領(lǐng)域是目前杜邦業(yè)務(wù)版圖中的重要一環(huán)，雖然涉足育種領(lǐng)域比較晚，但憑借強(qiáng)大的綜合實(shí)力，特別是在1999年全資并購當(dāng)時美國育種行業(yè)的龍頭企業(yè)——先鋒國際良種公司以后，杜邦一躍成為全球最大的農(nóng)業(yè)育種企業(yè)，并長期保持這一殊榮。

從圖5中可以看出，杜邦（先鋒）在該技術(shù)的研發(fā)上占有絕對的優(yōu)勢，不僅是開始最早的公司，在近十年來其他公司幾乎沒有針對該技術(shù)的專利申請的情況下，杜邦（先鋒）仍然沒有放棄對RFLP技術(shù)的研發(fā)。在RFLP技術(shù)20多年的發(fā)展歷程中，杜邦（先鋒）公司的申請量呈雙峰式發(fā)展趨勢。而申請量呈如此有規(guī)律的波動是與植物育種的周期性密切相關(guān)的。

迪卡公司曾經(jīng)是美國第二大玉米企業(yè)，1998年被孟山都公司收購后，在RFLP育種技術(shù)的研究上投入了相當(dāng)大的精力。但是，自2005年至今該公司并沒有提出相關(guān)的申請，似乎已放棄了對該技術(shù)的研發(fā)。

美國斯泰（STINE）公司是一家“非著名”的私人種業(yè)公司，長期致力于作物育種。該公司對于RFLP育種技術(shù)的研發(fā)集中在2001-2003年，之后便沒有針對該技術(shù)的申請。

RFLP技術(shù)在育種方面的應(yīng)用

作為第一代分子標(biāo)記技術(shù)，RFLP標(biāo)記輔助作物育種所涉及的作物種類比較豐富，各作物的申請量也比較平均（圖6），但涉及糧食作物：玉米、豆類作物的申請量依然較多，均為上百項(xiàng)；主要糧食作物：麥類、高粱和水稻的申請量也較多；經(jīng)濟(jì)作物：棉花；以及蔬菜作物：蕓苔屬植物的申請量也不在少數(shù)，均在30-50項(xiàng)之間。此外，煙草、番茄/茄子、向日葵、甜/辣椒、黃瓜、豌豆和薯類的申請量也在10項(xiàng)以上?？梢?，在RFLP發(fā)展的二十幾年里已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種作物的育種技術(shù)中。

在RFLP技術(shù)發(fā)展的前十年，對于該技術(shù)的研究主要集中在玉米、豆類和蕓薹屬這3類作物中。從1999年起，分子標(biāo)記技術(shù)得到了突破性發(fā)展，對于多種作物的RFLP育種研究技術(shù)也突飛猛進(jìn)，其中玉米和豆類是研究的重點(diǎn)。在第二個十年中，麥類、水稻、高粱、蕓薹屬、煙草等作物的RFLP育種研究均得到了較大的發(fā)展，申請量激增。而在2004年之后，各類作物的申請量均有下降，近幾年來已減少至每年10項(xiàng)以下，但是玉米和豆類的申請量始終比其他作物品種多。

圖5　歷年RFLP技術(shù)主要申請人申請量分布

圖6　RFLP技術(shù)申請量各領(lǐng)域分布

圖7　RFLP技術(shù)申請量（按性狀分布）

圖8　歷年RFLP技術(shù)申請量（按性狀分布）

圖9　主要申請國申請量（按領(lǐng)域分布）

圖10　主要申請國申請量（按性狀分布）

圖11　主要申請人申請量比例（按企業(yè)分）

作物多基因性狀方面，如抗病和抗逆相關(guān)研究在多基因控制性狀的發(fā)展最快。從圖7和圖8中可以看出，對作物抗性和單位面積產(chǎn)量的改良是研發(fā)熱點(diǎn)，在1999-2012年間，育種研發(fā)人員的關(guān)注焦點(diǎn)一直是對作物抗性和產(chǎn)量方面的改良，特別是對產(chǎn)量性狀RFLP標(biāo)記的開發(fā)早在1989年就已經(jīng)開始，并在2000年和2001年達(dá)到頂峰；此外，作物育性的改良、作物品質(zhì)的提升也是重要的育種目標(biāo)，與之相關(guān)的申請量僅次于抗性和產(chǎn)量改良。而關(guān)于抽穗期、株高、分蘗性狀相關(guān)的RFLP專利申請量則遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有抗性和產(chǎn)量的多，對這三個性狀RFLP標(biāo)記的研發(fā)也是間斷性地進(jìn)行，2001年是這三個性狀RFLP標(biāo)記研發(fā)的高峰期。而隨著分子標(biāo)記技術(shù)的更新?lián)Q代，對于作物RFLP標(biāo)記的研發(fā)勢頭在近幾年已大幅下降。

如圖9、10所示，在申請量排名前4位的主要申請機(jī)構(gòu)中，美國的申請量最大，較側(cè)重于玉米和豆類的研究，對于性狀的研究主要集中在抗性、產(chǎn)量、品質(zhì)和育性中；日本雖排名第二，但數(shù)量上遠(yuǎn)不及美國，對于RFLP技術(shù)的研究主要集中在水稻，并致力于抗性的提高；歐洲各國的申請量與日本相近，主要研究目標(biāo)既包括玉米、水稻、麥類等糧食作物，也包括番茄等蔬菜作物，對于性狀的改良也集中在抗性和育性的提高；而小麥作為中國重要的糧食作物，自然是研究的首要目標(biāo)，并且，我國的申請更注重抗性和品質(zhì)的提高。

在申請量排名前4位的主要申請人中，玉米的申請人主要為杜邦（先鋒）和迪卡兩家公司，而豆類的申請人則主要為美國斯泰公司，先正達(dá)公司則較側(cè)重于玉米中RFLP的研究（圖11）。

通過以上對RFLP育種技術(shù)相關(guān)的專利申請的初步分析，本文梳理了該技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)以及研究現(xiàn)狀，對于該技術(shù)未來的發(fā)展前景和展望，還有待于進(jìn)一步的深入研究和分析。

參考資料

1.董秀文，等.RFLP分析在作物育種上的應(yīng)用［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994，（4）.

2.沈革志.RFLP在作物育種上的應(yīng)用［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1992，8，（2）.

3.鄭康樂.分子標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用［M］.南京：江蘇省科學(xué)出版社，1991.

4.石運(yùn)慶，牟秋煥，李鵬，等.DNA分子標(biāo)記及其在作物遺傳育種中的應(yīng)用［J］.山東科學(xué)，2005，18（2）：22-28.

5.Halward T M，et al. RFLP map of peanut［A］.Phillips R L &Vasil I K. DNA -based markers in plants［C］，Nethelands：Kluwer Academic Publishers，1994，246-260.

（作者單位：國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作天津中心審查業(yè)務(wù)部；國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心醫(yī)藥生物發(fā)明審查部，專利審查員）