陳靈艷陳先進蔣燁呂暾

（1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福州 350108；2. 福州大北農(nóng)生物科技有限公司，福州 350014）

豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達研究

陳靈艷1陳先進2蔣燁1呂暾1

（1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福州 350108；2. 福州大北農(nóng)生物科技有限公司，福州 350014）

研究豬圓病毒衣殼蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達情況。以3個不同的質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建不同類型的豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白基因（PCV2-ORF2）重組表達載體，并分別轉(zhuǎn)化進入枯草芽孢桿菌168和WB800中。利用SDS-PAGE和Western blot檢測目的蛋白的表達，并通過實時熒光定量PCR檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄水平上的表達情況。結(jié)果顯示，ORF2基因原序列在枯草芽孢桿菌中難以表達，經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，構(gòu)建的截短ORF2基因表達載體在枯草芽孢桿菌內(nèi)表達系統(tǒng)中成功表達目的蛋白。密碼子優(yōu)化促進了目的基因的表達。

豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白；枯草芽孢桿菌；實時定量PCR；密碼子優(yōu)化

20世紀70年代首次發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）， 在 傳 代 培 養(yǎng)PK15細 胞 中，Tischer鑒定出一種細小的病毒樣粒子。8年之后，Tischer等［1］對病毒樣的純化核酸樣品進行核酸敏感性分析、沉降分析、電子顯微鏡觀察之后得以證明，該病毒的基因組是由一個大小為1.76 kb閉環(huán)單鏈DNA（ssDNA）構(gòu)成，并命名為豬圓環(huán)病毒。PCV有兩個基因型，PCV1為非致病性病毒，PCV2為致病性病毒。PCV2是養(yǎng)豬業(yè)的危害性比較大的病毒病原體，該病毒能引起多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）和豬皮炎和腎病綜合癥（PDNS），給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來重大損失［2］。

通常通過注射疫苗來預(yù)防豬圓環(huán)病毒引起的相關(guān)疾病。亞單位疫苗是指采用微生物某種表面結(jié)構(gòu)成分（如抗原）制成的不含核酸，且能有效激發(fā)機體產(chǎn)生抗體，純品可以直接注射使用的疫苗［3］。以亞單位疫苗為代表的新一代疫苗，其安全性遠遠大于傳統(tǒng)疫苗。采用基因工程方法，人們能通過克隆得到編碼病毒保護性抗原的基因，并且在體外對其進行改造或者修飾，再將其重新轉(zhuǎn)移至異源生物宿主體內(nèi)或者培養(yǎng)細胞中，以獲得病毒蛋白的大量表達?；蚬こ虂唵挝灰呙缡窃谠嘶蛘婧思毎斜磉_抗原基因，再將此生物合成的基因產(chǎn)物制成疫苗［4］。

Cap蛋白是PCV2病毒的衣殼蛋白和主要免疫原性蛋白。Cap蛋白基因編碼蛋白的N端1-41位氨基酸為高度保守且富含堿性氨基酸的核定位序列（NLS），第12-18和34-41位氨基酸對Cap蛋白在細胞核中的定位起了決定作用，但該核定位序列不含主要的抗原位點［5］，該序列中含有大量串聯(lián)的稀有密碼子，稀有密碼子會制約翻譯的速率與效率。對于難于表達的外源基因可通過優(yōu)化密碼子實現(xiàn)高水平或者增量表達。2009年，Marcekova和Bumba［6］首先報道了一個優(yōu)化序列（GenBank EU376523），使得ORF2蛋白在大腸桿菌BL21中獲得了10 mg/L的表達量。2012年，Wu和Huang等［7］報道了一個優(yōu)化的序列（GenBank AY885225），也獲得了全長蛋白的成功表達。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）隸屬芽孢桿菌屬，是單細胞的原核生物，細胞壁不含有內(nèi)毒素，為好氧型的革蘭氏陽性菌。枯草芽孢桿菌自身不產(chǎn)毒素和致熱致敏蛋白質(zhì)，也不具致病性，而且只有單層的細胞膜，能直接分泌大量蛋白至培養(yǎng)基中，使其成為一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌株［8］。自20世紀60年代以來，國內(nèi)外研究者就深入研究了枯草芽孢桿菌的生理、生化、分子生物學(xué)及遺傳特性，將其作為革蘭氏陽性細菌的典型代表［9］?？莶菅挎邨U菌表達系統(tǒng)一個限制因素是胞外蛋白酶，枯草芽孢桿菌中應(yīng)用最為廣泛的宿主B. subtilis 168，生長到對數(shù)末期時會分泌表達大量多種蛋白酶，導(dǎo)致一些特別是蛋白酶敏感的目的蛋白降解，大大降低了蛋白產(chǎn)率。Wu等［10］利用基因失活的突變方法，成功構(gòu)建一株枯草桿菌蛋白酶、金屬蛋白酶、中性蛋白酶A、中性蛋白酶B、芽孢桿菌肽酶F和胞外蛋白酶等基因缺失的菌株WB800，胞外蛋白酶的活力只有野生型的0.32%，用此菌株表達的β-半乳糖苷酶，表達量提高了16倍。

本研究通過將不同長度和優(yōu)化前后的PCV2-ORF2基因構(gòu)建到不同啟動子的表達載體上，通過SDS-PAGE和Western blot檢測目的蛋白的表達，并通過RT-qPCR檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄水平上的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 豬圓環(huán)病毒2型DBN-SX07毒株由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供；質(zhì)粒pHT43、pXYL，枯草芽孢桿菌168、WB800由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 各種DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DL2000 DNA Ladder Marker、Protein Molecular Weight Marker等購自TaKaRa公司；DEPC、Total RNA Extractor（Trizol）、RNase free-DNase I、瓊脂糖M、IPTG、Tris飽和酚、SanPrep柱式膠回收試劑盒、氨芐青霉素鈉、氯霉素等均購自生工生物工程（上海）有限公司；PCR Mix、Goldview等購自于北京鼎國生物有限公司；無液氮RNA樣品儲存液購于百泰克；M-MLV First Strand kid購于Invitrogen；Top Green qPCR SuperMix TMB、HRP標記抗體購于全式金；DAB底物顯色液試劑盒購于康為世紀；酵母提取物Yeast extract、胰蛋白胨Tryptone購自O(shè)xoid公司；其它試劑均采用進口分裝或國產(chǎn)分析純。

LB液體培養(yǎng)基：1.0% Tryptone、0.5% Yeast Extract、1.0% NaCl，pH7.0。

LB固體培養(yǎng)基：在上述LB液體培養(yǎng)基中加1.5%的瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 提取DBN-SX07毒株的基因組，根據(jù)NCBI公布的DBN-SX07毒株的ORF2基因序列（HM641752.1），設(shè)計全長基因ORF2及截短基因ORF2'的上下游引物，擴增全長702 bp及去除N端123個堿基核定位序列的579 bp的目的片段，分別克隆至IPTG誘導(dǎo)的表達載體pHT43及木糖誘導(dǎo)的表達載體pXYL的相應(yīng)位點，構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達載體，即pHT43-ORF2、pHT43-ORF2'、pXYL-ORF2及pXYL-ORF2'。將載體質(zhì)粒pHT43的信號肽去除，構(gòu)建一個枯草芽孢桿菌胞內(nèi)的表達載體pHT43-A。克隆ORF2基因的全長及截短基因至該表達載體上，分別構(gòu)建表達載體pHT43-A-ORF2及 pHT43-A-ORF2'，也將優(yōu)化ORF2基因后的全長及截短基因克隆至此表達載體中得到O-pHT43-A-ORF2及O-pHT43-A-ORF2'。在本次實驗中涉及的基因與質(zhì)粒，見于表1。

表1 本次實驗中涉及的基因與質(zhì)粒

1.2.2 目的蛋白的表達和檢測 將構(gòu)建成功的表達載體通過Spizizen法制備枯草芽胞桿菌感受態(tài)細胞，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入枯草芽胞桿菌；通過菌液PCR驗證轉(zhuǎn)化子，挑選陽性克隆；轉(zhuǎn)接陽性克隆至新鮮LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)OD600達到0.5時，加IPTG（終濃度1 mmol/L）或者木糖誘導(dǎo)表達目的蛋白，以不誘導(dǎo)的菌株作為對照，通過SDS-PAGE和Western blot驗證目的蛋白的表達。

1.2.3 RT-qPCR檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄水平 挑取陽性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接至新鮮LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600達到0.5時，加IPTG（終濃度1 mmol/L）或者木糖誘導(dǎo)表達目的蛋白，以不誘導(dǎo)的菌株作為對照，誘導(dǎo)6 h以后，離心收集菌體，利用Trizol提取實驗組和對照組樣本的RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，購自全式金生物技術(shù)有限公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，以L7Ae作為內(nèi)參基因，進行qPCR，每組3個重復(fù)，將Ct值通過比較Ct值法轉(zhuǎn)化為相對表達量，計算基因的在轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

利用雙酶切將目的基因構(gòu)建到表達載體上，形成重組質(zhì)粒，通過熱激法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，菌液PCR后進行瓊脂糖凝膠電泳，有目的條帶產(chǎn)生（數(shù)據(jù)未給出），將陽性克隆送去生工生物有限公司測序，經(jīng)序列比對，無突變位點。構(gòu)建的重組質(zhì)粒圖譜，如圖1。

2.2 目的蛋白檢測

將構(gòu)建好的表達載體pHT43-ORF2、pHT43-ORF2'及pXYL-ORF2、pXYL-ORF2'分別轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌宿主菌168及WB800中，誘導(dǎo)表達后，裂解細胞，獲得菌體蛋白，然后經(jīng)SDS-PAGE及Western blot，都未出現(xiàn)目的條帶（數(shù)據(jù)未給出），說明以上4個分泌表達重組質(zhì)粒未能在枯草芽孢桿菌中成功表達。載體pHT43-A-ORF2及pHT43-AORF2'轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌168及WB800，誘導(dǎo)后檢測后也沒有目的蛋白表達（數(shù)據(jù)未給出）。因幾個重組質(zhì)粒均不能成功表達目的蛋白，故對全長和截短基因進行稀有密碼子的優(yōu)化，以使目的基因能夠在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中成功表達。優(yōu)化全長和截短基因重組質(zhì)粒O-pHT43-A-ORF2及O-pHT43-A-ORF2'也被轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌168和WB800，誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測（圖2），優(yōu)化的全長基因未能表達，但是優(yōu)化的截短基因卻能成功表達。

圖1 表達載體的構(gòu)建

圖2 Western blot檢測枯草芽孢桿菌中重組Cap蛋白的表達

2.3 目的基因轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果

將轉(zhuǎn)化有表達載體pHT43-ORF2及pHT43-ORF2'的枯草芽孢桿菌168分別命名為B.subtilis 168（pHT43-ORF2） 及 B. subtilis 168（pHT43-ORF2'），采用B.subtilis 168的核糖體蛋白L7Ae作為內(nèi)參，以未誘導(dǎo)的表達菌體作為對照組，以誘導(dǎo)的表達菌株作為實驗組，進行RT-qPCR。根據(jù)目的基因及參考基因的擴增曲線圖及熔解曲線圖分析數(shù)據(jù)的可靠性，由比較Ct值法即2-△△Ct，其中ΔΔ Ct=（Ct目的基因- Ct參考基因）實驗組-（Ct目的基因- Ct參考基因）對照組計算，得到B. subtilis 168（pHT43 -ORF2）中誘導(dǎo)ORF2基因相對內(nèi)參基因L7Ae轉(zhuǎn)錄表達量為278.2041，B. subtilis 168（pHT43-ORF2'）中誘導(dǎo)ORF2截短基因相對內(nèi)參基因L7Ae轉(zhuǎn)錄表達量為60.72，所得結(jié)果如圖3所示，圖3說明了全長與短截的目的基因都有轉(zhuǎn)錄至mRNA，且全長基因的mRNA表達量是截短基因的4.5倍左右。

圖3 B.subtilis 168（pHT43-ORF2）中ORF2全長基因以及B.subtilis 168（pHT43-ORF2'）中ORF2截短基因的mRNA相對表達量

將轉(zhuǎn)化有表達載體pHT43-A-ORF2'及O-pHT43-A-ORF2'的枯草芽孢桿菌168分別命名為B.subtilis 168（pHT43-A-ORF2'）及B.subtilis 168（O-pHT43-AORF2'），采用B.subtilis168的核糖體蛋白L7Ae作為內(nèi)參，以誘導(dǎo)的未優(yōu)化截短基因的表達菌體作為對照組，以誘導(dǎo)的優(yōu)化截短基因的表達菌株作為實驗組，進行RT-qPCR。根據(jù)目的基因及參考基因的擴增曲線圖及熔解曲線圖分析數(shù)據(jù)的可靠性，由比較Ct值法計算，得到B.subtilis 168（pHT43-A-ORF2'）中ORF2基因相對于內(nèi)參基因L7Ae的相對表達量為37.96（圖4-A）；B.subtilis 168（O-pHT43-A-ORF2'）中ORF2基因相對內(nèi)參基因L7Ae的相對表達量為10.31（圖4-A）；B.subtilis 168（O-pHT43-A-ORF2'）中ORF2基因相對B.subtilis 168（pHT43-A-ORF2'）中ORF2基因的轉(zhuǎn)錄表達量為0.27（圖4-B）。

從圖4可以看出，優(yōu)化后的短截基因的mRNA的表達水平低于未優(yōu)化的短截基因，說明優(yōu)化的截短基因的轉(zhuǎn)錄水平有所降低。

圖4 優(yōu)化前后截短ORF2基因的相對表達量

將轉(zhuǎn)化有表達載體pHT43-A-ORF2及O-pHT43-A-ORF2的枯草芽孢桿菌168分別命名為B.subtilis 168（pHT43-A-ORF2）及B.subtilis 168（O-pHT43-AORF2），采用B.subtilis 168的核糖體蛋白L7Ae作為內(nèi)參，以誘導(dǎo)的未優(yōu)化截短基因的表達菌體作為對照組，以誘導(dǎo)的優(yōu)化截短基因的表達菌株作為實驗組，進行RT-qPCR。根據(jù)目的基因及參考基因的擴增曲線圖及熔解曲線圖分析數(shù)據(jù)的可靠性，由比較Ct值法計算，得到B.subtilis 168（pHT43-A-ORF2）中ORF2基因相對于內(nèi)參基因L7Ae的相對表達量為11.37（圖5-A）；B.subtilis 168（O-pHT43-A-ORF2）中ORF2基因相對內(nèi)參基因L7Ae的相對表達量為10.77（圖5-A）；B.subtilis 168（O-pHT43-A-ORF2）中ORF2基因相對B.subtilis 168（pHT43-A-ORF2）中ORF2基因的轉(zhuǎn)錄表達量為0.94（圖5-B）。

從圖5可以看出，優(yōu)化后的全長基因的mRNA的表達量低于未優(yōu)化的全長基因，說明全長基因被優(yōu)化后轉(zhuǎn)錄水平降低了。

圖5 優(yōu)化前后全長ORF2基因的相對表達量

3 討論

本研究根據(jù)枯草芽孢桿菌的表達系統(tǒng)特點，優(yōu)化PCV2的稀有密碼子，成功表達了不含NLS序列的Cap蛋白，但Western blot檢測到目的條帶，說明此優(yōu)化策略對于蛋白表達是有效的，要提高蛋白表達量需進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)條件或者增加分子伴侶。

在枯草芽孢桿菌內(nèi)分泌表達系統(tǒng)中，目的基因密碼子優(yōu)化之后，不論是全長基因還是截短基因的轉(zhuǎn)錄水平均要低于優(yōu)化之前，說明優(yōu)化目的基因在轉(zhuǎn)錄水平能夠表達，但目的基因優(yōu)化后轉(zhuǎn)錄水平上有所降低；經(jīng)過優(yōu)化后的全長和截短基因在內(nèi)表達系統(tǒng)中經(jīng)過誘導(dǎo)后，只檢測到截短的基因有所表達，全長基因未表達。按照合理的推論，優(yōu)化后的全長和截短基因都能在正常表達，這與實驗結(jié)果是矛盾的，分析原因可能是全長基因N端的信號肽中仍然含有優(yōu)化不到或者無法優(yōu)化的密碼子，或者一種尚未被發(fā)現(xiàn)的細胞機制在起著作用，致使全長的基因翻譯過程受到阻礙。

優(yōu)化后的截短基因分別轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌168菌株和WB800菌株，誘導(dǎo)表達之后都有檢測到目的蛋白，且表達量相差較小。由于WB800是在枯草芽孢桿菌168菌株基礎(chǔ)上缺失8個胞外蛋白酶基因，截短ORF2基因在兩株菌中的表達量沒有明顯差異，表明胞外蛋白酶基因?qū)δ康牡鞍椎谋磉_影響較小。

本實驗中用到了兩種不同的啟動子Pxyl和Pgrac，其中Pgrac啟動子所在的重組質(zhì)粒實現(xiàn)了目的蛋白的表達，但是木糖啟動子（Pxyl）所在的重組質(zhì)粒沒有實現(xiàn)表達，可能是由于不同的啟動子識別的σ因子有所不同，實驗所用的菌株剛好不適合用木糖啟動子。同時，本實驗采用了不同的誘導(dǎo)基因，主要是木糖誘導(dǎo)基因（XylR）和IPTG誘導(dǎo)基因（lacI），木糖誘導(dǎo)時沒有實現(xiàn)目的蛋白的表達，IPTG 誘導(dǎo)實現(xiàn)了目的蛋白的表達，目前木糖誘導(dǎo)基因在枯草芽孢桿菌中的報道比較少，Gartner等［5］研究發(fā)現(xiàn)，木糖操縱子是一負操縱子，其調(diào)節(jié)作用由一阻遏蛋白執(zhí)行，可能本實驗所使用的宿主中這一蛋白沒有表達或者表達量不足以激起該操縱子的作用。

4 結(jié)論

本研究通過密碼子優(yōu)化，利用內(nèi)分泌系統(tǒng)，成功地在枯草芽孢桿菌中表達了豬圓環(huán)病毒ORF2截短基因。分別在轉(zhuǎn)錄與翻譯的水平上分析豬圓環(huán)病毒ORF2基因的表達情況，已經(jīng)可以確定該基因不能在枯草芽孢桿菌中較好地表達的原因主要是翻譯過程出現(xiàn)了問題。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Research on the Expression of Porcine Circovirus Capsid Protein in the Bacillus subtilis

CHEN Ling-yan1CHEN Xian-jin2JIANG Ye1Lü Tun1
（1. College of Biology Science and Technology，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou 350108；2. Fuzhou Dabeinong Biotech Co.，Ltd. Fuzhou 350014）

The objective is to study the expression of porcine circovirus capsid protein in the Bacillus subtilis. Based on 3 different plasmids，different types of recombinant vectors for porcine circovirus capsid protein gene（PCV2-ORF2）were constructed，and they were transformed into strain 168 and WB800 of B. subtilis. The expression of the target protein was detected by SDS-PAGE and Western blot，and the mRNA expression of the target gene in B. subtilis was detected through RT-qPCR. The original ORF2 was difficult to be translated in B. subtilis expression system. After the codon optimization，truncated ORF2 gene was successfully expressed as target protein in intracellular expression system of B. subtilis. Thus，the optimization of the codons promoted the expression of the target gene.

porcine circovirus capsid protein；Bacillus subtilis；RT-qPCR；codon optimization.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.018

2015-08-03

2013年福建省產(chǎn)學(xué)研重大專項（2012G106）

陳靈艷，女，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：871804232@qq.com

呂暾，男，研究員，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：lvtun@yahoo.com