陳李鵬 黃勇富 趙永聚 俄廣鑫 娜日蘇

（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716）

采用6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)研究6個(gè)綿羊品種遺傳多樣性

陳李鵬 黃勇富 趙永聚 俄廣鑫 娜日蘇

（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716）

利用6個(gè)微衛(wèi)星座位對(duì)中國(guó)烏珠穆沁羊、小尾寒羊、灘羊、昭通綿羊、呼倫貝爾羊和甘肅高山細(xì)毛羊6個(gè)綿羊品種，共計(jì)280個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析。計(jì)算了6個(gè)綿羊品種間的多態(tài)信息含量、雜合度和遺傳距離，并進(jìn)行了主成分分析和UPGMA聚類。發(fā)現(xiàn)了101個(gè)等位基因，平均雜合度0.599-0.691，平均多態(tài)信息含量0.609-0.680；甘肅高山細(xì)毛羊與其他綿羊品種遺傳分歧最大，而呼倫貝爾羊與烏珠穆沁羊間的分歧最小。結(jié)果表明6個(gè)綿羊品種均具有較高的遺傳多樣性，品種間的遺傳關(guān)系與其形成歷史、分化及地理分布基本一致。

微衛(wèi)星；遺傳多樣性；綿羊

我國(guó)地方綿羊品種眾多，遺傳資源十分豐富，是世界少有的寶貴基因庫(kù)［1］，但受世界范圍內(nèi)商業(yè)品種的沖擊，導(dǎo)致市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力低的地方品種逐漸走向衰落。因此，對(duì)中國(guó)綿羊品種遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估和保護(hù)，已是當(dāng)務(wù)之急。

微衛(wèi)星又稱簡(jiǎn)單串連重復(fù)序列，一般由2-6 bp組成核心序列，重復(fù)10-20次，首尾相接而組成［2］。它廣泛存在于真核生物的基因組中，可通過(guò)PCR擴(kuò)增和電泳分型，具有數(shù)量多、多態(tài)性豐富、保守性好、共顯性遺傳以及檢測(cè)方便快速等優(yōu)點(diǎn)［3-5］，在度量品種遺傳多樣性、估測(cè)品種間遺傳距離及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)等研究中顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)。目前，有很多學(xué)者應(yīng)用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)對(duì)綿羊的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。如Sun等［6］利用15個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估了5個(gè)綿羊品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明群體遺傳結(jié)構(gòu)與群體間的遺傳距離不一致。Agaviezor等［7］利用15個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了4個(gè)尼日利亞綿羊品種共384只綿羊的遺傳多樣性，結(jié)果表明綿羊品種內(nèi)遺傳變異高于品種間遺傳變異。Yilmaz等［8］利用18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了9個(gè)綿羊品種的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)歐洲綿羊品種的遺傳變異高于土耳其綿羊品種；Leroy等［9］利用21個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了49個(gè)綿羊品種的遺傳多樣性，評(píng)估了法國(guó)部分綿羊品種的起源分化模式。?urkovi?等［10］利用30個(gè)微衛(wèi)星分析了18個(gè)綿羊品種的遺傳多樣性，評(píng)估了綿羊品種形成過(guò)程中自然和人工選擇的重要性。

本研究選取呼倫貝爾羊、烏珠穆沁羊、小尾寒羊、灘羊和昭通綿羊等5個(gè)中國(guó)地方綿羊品種，以及甘肅高山細(xì)毛羊1個(gè)培育品種，在常染色體基因組水平上研究6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性和遺傳分化關(guān)系，旨在為揭示其品種遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳背景，以及下一步開(kāi)展資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本 本實(shí)驗(yàn)樣本采自6個(gè)綿羊品種分布的主產(chǎn)區(qū)，每個(gè)品種隨機(jī)采集無(wú)親緣關(guān)系個(gè)體40只或48只，共計(jì)280只。所采血樣為8-10 mL/只，用檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃凍存。各品種的樣本信息，見(jiàn)表1。

表1 6個(gè)綿羊品種的樣本信息

1.1.2 微衛(wèi)星引物 根據(jù)相關(guān)微衛(wèi)星選擇標(biāo)準(zhǔn)，并綜合考慮微衛(wèi)星位點(diǎn)在染色體中位置、引物序列組成特點(diǎn)、微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性和產(chǎn)物大小等多方面因素，最后確定了分布于5條不同常染色體上的6對(duì)微衛(wèi)星引物，分別為 OarJMP29、OarAE129、MCM-527、ILSTS005、MAF209和OarFCB304（表2）。

表2 6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的信息

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用基因組DNA提取試劑盒提取全血中的基因組DNA，-20℃保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用20 μL反應(yīng)體系，其中各組分的終濃度分別為dNTPs 0.2 mmol/L、Mg2+1.5 mmol/L、混合上下游引物0.5 mmol/L、Taq酶5 U/μL、D NA模板1 μL（約60 ng）。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50-60℃退火30 s，72℃延伸30 s，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)；于72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用ABI 3130 xl全自動(dòng)基因分析儀進(jìn)行分型檢測(cè)，片段分析的上樣操作參照曾盛誠(chéng)［11］的文獻(xiàn)報(bào)道。

1.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理 利用Microsatellite Toolkit軟件計(jì)算各微衛(wèi)星座位的等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量（PIC）、觀察雜合度（HO）和期望雜合度（HE）等參數(shù)［12］，Arlequin 3.5.1.3軟件計(jì)算6個(gè)品種間遺傳距離（DS）［13］，GENEPOP 3.4軟件進(jìn)行哈德溫伯格平衡檢驗(yàn)［14］，F(xiàn)stat 2.9.3.2軟件計(jì)算群體近交系數(shù)（FIS）［15］，MVSP3.1軟件進(jìn)行品種間遺傳分化的主成分分析和UPGMA聚類分析［16，17］。

2 結(jié)果

2.1 等位基因分布

6個(gè)綿羊品種微衛(wèi)星座位的等位基因分布見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn) ，在OarFCB304座位檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多，達(dá)到24個(gè)，OarAE129座位檢測(cè)到的等位基因數(shù)最少，為9個(gè)，6個(gè)綿羊品種在6個(gè)微衛(wèi)星座位中共檢測(cè)到101個(gè)等位基因，平均每個(gè)座位的等位基因數(shù)為16.8；同一個(gè)微衛(wèi)星座位，在不同品種間的等位基因分布也不同，如在OarJMP29座位上，UQ、ZT、HBR、STH、TAN、GSH檢測(cè)到的等位基因數(shù)分別為10、9、11、8、9、7。

表3 6個(gè)微衛(wèi)星座位在6個(gè)綿羊品種中的等位基因數(shù)

2.2 品種內(nèi)的遺傳變異檢測(cè)

2.2.1 觀測(cè)雜合度和期望雜合度 6個(gè)綿羊品種的觀測(cè)雜合度（HO）和期望雜合度（HE）的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。就座位而言，MAF209 座位的平均HO最高，達(dá)到0.764；OarAE129 座位的平均HO最低。就品種而言，6個(gè)綿羊品種的群體雜合度均較高，除ZT的HO為0.599外，其余都在 0.6-0.7之間，屬于高度雜合群體。

2.2.2 多態(tài)信息含量（PIC） 由表4可知，就座位而言，6個(gè)微衛(wèi)星座位平均PIC值在0.505-0.755 之間，表現(xiàn)為高度多態(tài)，MCM527座位平均PIC值最大，達(dá)到 0.755。表明所選6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均具有較高的多態(tài)性，能夠提供大量的遺傳信息，可作為有效的分子遺傳標(biāo)記用于群體遺傳多樣性分析。就品種而言，6個(gè)綿羊品種PIC均高于0.5。GSH為培育品種，平均PIC值為0.672，其余5個(gè)地方綿羊品種平均PIC值在0.609-0.680間分布，表明這6個(gè)綿羊品種的遺傳多樣性較高，具有很高的育種潛力。

2.2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 本研究中Hardy-Weinbery 平衡檢驗(yàn)結(jié)果（表5）顯示，GSH在2個(gè)基因座處于哈溫不平衡、其余5個(gè)綿羊品種均在1個(gè)基因座處于不平衡狀態(tài)。

2.2.4 群體內(nèi)近交系數(shù) 6個(gè)綿羊品種的近交系數(shù)（FIS）測(cè)定值（表6）顯示，6個(gè)綿羊品種的FIS范圍是0.041-0.166，6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均FIS值在-0.005-0.254 7之間，矯正后的P值為0.001 4，除ZT的P值與校正后的P值相同外，其余5個(gè)品種的P值都大于校正后的P值，顯示近交程度不明顯。ZT的FIS值最大（FIS=0.166），其近交程度較高，通過(guò)校正其近交系數(shù)顯著偏離0，這可能與尚未建立ZT的保護(hù)區(qū)和保種場(chǎng)和處于農(nóng)戶自繁自養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)。

2.3 品種間的遺傳關(guān)系

2.3.1 遺傳距離 基于SSR數(shù)據(jù)計(jì)算了6個(gè)綿羊品種間的Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離（DS），結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可見(jiàn)，UQ、ZT、HBR、STH和TAN 5個(gè)地方品種之間遺傳距離在0.012-0.156之間，HBR與UQ遺傳距離最小，STH與UQ和HBR兩個(gè)品種間的遺傳分歧較小，GSH與其他5個(gè)地方品種之間的遺傳距離均較大。

表 4 6個(gè)綿羊品種在6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的遺傳變異參數(shù)

表5 哈溫平衡檢測(cè)各品種各基因座P值

2.3.2 聚類分析 主成分分析是揭示群體間遺傳分化程度和遺傳關(guān)系的一種聚類方法，研究群體間在多個(gè)標(biāo)記座位上的差異性，具有多變量的特征［18］?；谖⑿l(wèi)星數(shù)據(jù)，利用MVSP3.1軟件進(jìn)行了主成分分析，結(jié)果如表8所示，在5個(gè)主成分中前3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到76.795%，足以代表原始因子的大部分信息，據(jù)此繪制主成分分析散點(diǎn)圖（圖1）。其中第1主成分、第2主成分和第3主成分分別占總變異的38.02%、23.19%和15.58%。

在前3個(gè)主成分中，第1主成分將GSH與其他5個(gè)地方品種分開(kāi)；第2主成分將ZT從5個(gè)地方品種中分出；第3主成分將UQ、HBR和STH分為一類，與TAN分開(kāi)。同樣利用MVSP3.1軟件進(jìn)行了UPGMA聚類分析，結(jié)果如表9所示，據(jù)此得到聚類圖（圖2），與主成分分析結(jié)果基本一致。

表 6 六個(gè)綿羊品種的近交系數(shù)

表7 6個(gè)綿羊品種間的遺傳距離

表9 UPGMA聚類結(jié)果

表8 MVSP主成分分析結(jié)果

3 討論

3.1 遺傳多樣性和遺傳分化分析

本研究所用的6個(gè)微衛(wèi)星座位在6個(gè)綿羊品種中均檢測(cè)到9個(gè)以上等位基因，各座位的多態(tài)信息含量都很高。根據(jù)Bolstein等［19］提出的基因變異程度衡量指標(biāo)，本研究涉及的6個(gè)微衛(wèi)星座位均屬高度多態(tài)基因座。因此，初步認(rèn)為這6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記是普遍適合于綿羊遺傳分化的多態(tài)標(biāo)記。

多態(tài)信息含量（PIC）是群體內(nèi)遺傳變異的量度指標(biāo)，可用來(lái)描述微衛(wèi)星位點(diǎn)的變異程度。Ma等［20］利用30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了12個(gè)地方綿羊品種的遺傳多樣性，平均PIC在0.519-0.666之間；儲(chǔ)明星等［21］利用2個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)5個(gè)綿羊品種的研究結(jié)果得出平均PIC為0.60；本研究中6個(gè)微衛(wèi)星均為高度多態(tài)，其中以MCM527的多態(tài)性最高，為0.755。

雜合度又稱基因多樣性，反映群體在多個(gè)位點(diǎn)上的遺傳變異。一般認(rèn)為它是度量群體遺傳變異的一個(gè)重要參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)所選取的6個(gè)微衛(wèi)星平均HE在0.544-0.795之間，6個(gè)綿羊品種的平均HO為0.599-0.691，表明這6個(gè)綿羊品種具有豐富的遺傳變異和較高的遺傳多樣性。呂慎金等［22］利用30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記得出8個(gè)綿羊群體的平均雜合度為0.539-0.714。儲(chǔ)明星等［23］用5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記揭示的STH平均雜合度為0.456 9，而本研究中6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記得到STH的平均雜合度為0.671，表明本研究中所選擇的微衛(wèi)星座位具有較高的多態(tài)性。

圖 1 6個(gè)綿羊品種前3個(gè)主成分的三維散點(diǎn)圖

圖 2 6個(gè)綿羊品種間的UPGMA聚類圖

微衛(wèi)星DNA本身是選擇中性的，不受選擇的壓力，因此在一個(gè)理想群體中各等位基因在群體中的分布頻率應(yīng)該是穩(wěn)定的［24］。通過(guò)哈代溫伯格平衡檢驗(yàn)6個(gè)座位，發(fā)現(xiàn)MAF209、OarJMP29和OarFCB304三個(gè)座位在6個(gè)品種都處于平衡狀態(tài)，ILSTS005座位在GSH偏離平衡，MCM527座位在ZT和GSH偏離平衡，OarAE129在UQ、HBR、STH和TAN等4個(gè)品種中偏離哈代溫伯格平衡。

3.2 遺傳距離和聚類分析

該研究通過(guò)Arlequin軟件計(jì)算得到了Nei 氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離，應(yīng)用MVSP 3.1進(jìn)行了主成分分析和UPGMA聚類。通過(guò)這兩種方法，發(fā)現(xiàn)6個(gè)綿羊品種間的聚類結(jié)果與遺傳距離基本一致。一般認(rèn)為群體分化時(shí)間越短，遺傳距離越小，HBR、UQ、STH和TAN等4個(gè)本地品種之間的遺傳距離較小，ZT與這4個(gè)品種之間的遺傳距離相對(duì)較大。而培育品種GSH與5個(gè)地方品種遺傳距離均較大，獨(dú)自聚為一類，聚類結(jié)果與品種的形成史、分化及地理分布基本一致。如HBR與UQ遺傳距離最小，首先聚為一類，它們均來(lái)自內(nèi)蒙古，生活環(huán)境極為相似，均是在當(dāng)?shù)亻L(zhǎng)期的自然和人工選擇情況下而逐漸育成的肉脂兼用型綿羊品種［25］。GSH是從1950年開(kāi)始，采用復(fù)雜育成雜交方法進(jìn)行培育，于1981年育成的培育品種［26］，與其他5個(gè)地方綿羊品種遺傳距離最大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

HBR、UQ、STH和TAN等4個(gè)品種均隸屬于蒙古羊系統(tǒng)，起源于共同的祖先群體而親緣關(guān)系相對(duì)較近，有相關(guān)研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。如仲濤等［27］采用21個(gè)微衛(wèi)星座位，運(yùn)用DA遺傳距離將9個(gè)地方綿羊品種進(jìn)行了分類，其中屬于蒙 古羊系的UQ、HBR、TAN和湖羊聚 為一類。郭小雅等［28］分析了我國(guó)6個(gè)綿（山）羊品種的遺傳分化，進(jìn)一步證明了UQ和STH、TAN、湖羊、同羊有較近的親緣關(guān)系，共同歸屬于“蒙古羊”系。任春環(huán)等［29］分析了5個(gè)綿羊品種的遺傳多態(tài)性，結(jié)果表明TAN與STH的親緣關(guān)系較近。馬月輝等［1］采用30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)12個(gè)中國(guó)地方綿羊品種和一個(gè)外來(lái)品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)蘇尼特羊和UQ首先聚為一類，TAN和STH聚為一類，然后這4個(gè)品種作為一個(gè)分支聚為一類。本研究中TAN與STH遺傳距離較小為0.076，STH與UQ遺傳距離最小為0.040，本研究中僅用了6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析6個(gè)綿羊品種遺傳多樣性，但與先前研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明本研究采用的6個(gè)高度多態(tài)微衛(wèi)星在一定程度上能夠反映綿羊群體的遺傳結(jié)構(gòu)。

昭通綿羊的起源有可能是云南本土或是由西藏的野生綿羊馴化而來(lái)［27］。蘭蓉等［30］對(duì)云南綿羊進(jìn)行了線粒體DNA和血液蛋白多態(tài)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)昭通綿羊和印度綿羊、尼泊爾綿羊關(guān)系較近，而與西藏綿羊關(guān)系較遠(yuǎn)，但其起源還有待于深入研究。仲濤等［31］對(duì)中國(guó)部分綿羊品種的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，表明昭通綿羊與其他藏系綿羊間遺傳分化較明顯，支持了昭通綿羊起源于云南本土的說(shuō)法。婁淵根等［32］認(rèn)為昭通綿羊因位于云貴高原，地理隔離阻礙了其與其他品種的基因交流，使其在分類上自成一類。本研究中昭通綿羊與其他5個(gè)綿羊品種遺傳距離較大，主成分分析和聚類分析也得到相同的結(jié)果，研究結(jié)果支持昭通綿羊起源于云南本土的說(shuō)法。

4 結(jié)論

本研究選用的6個(gè)微衛(wèi)星為高度多態(tài)性位點(diǎn)，在一定程度上可以反映綿羊群體的遺傳結(jié)構(gòu)。通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)綿羊品種具有豐富的遺傳變異和較高的遺傳多樣性。品種間遺傳距離分析、主成分分析及UPGMA聚類，結(jié)果均一致說(shuō)明培育品種GSH與其他5個(gè)地方品種的遺傳分歧最大，HBR與UQ遺傳分歧最?。籗TH、TAN、HBR和UQ共同歸屬于蒙古羊系，親緣關(guān)系相對(duì)較近，進(jìn)一步證實(shí)了STH與TAN親緣關(guān)系較近的說(shuō)法，各綿羊品種間的遺傳關(guān)系與其形成史、分化及地理分布基本一致，昭通綿羊與其他綿羊品種間的遺傳距離較大，支持了其起源于云南本地的觀點(diǎn)。

致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所馬月輝研究員、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院仲濤副研究員在樣品采集中給予的幫助。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Genetic Diversity of Six Chinese Sheep Breeds by Six Microsatellite Markers

CHEN Li-peng HUANG Yong-fu ZHAO Yong-ju E Guang-xin NA Ri-su
（College of Animal Science and Technology，Southwest University，Chongqing 400716）

Six microsatellite loci were used to analyze the genetic diversity of 280 sheep from 6 Chinese bre eds of Ujumqin sheep，Smalltailed Han sheep，Tan sheep，Zhaotong sheep，Hulun Buir sheep，and Gansu Alpine Merino. We calculated the polymorphism information content，heterozygosity and genetic distance，analyzed the principal components and clustered UPGMA from these 6 sheep breeds. Altogether，101 alleles were found，the mean heterozygosity was 0.599-0.691，and mean polymorphism information content was 0.609-0.680. The Gansu Alpine Merino sheep had the most genetic divergence compared to other sheep breeds，while the Hulun Buir and Ujumqin ones were the least in genetic divergence. The above results showed that these 6 breeds had relatively high genetic diversity，and their genetic relationships were consistent with their formation history，differentiation and geographical distribution.

microsatellite；genetic diversity；sheep

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.012

2015-07-28

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（SWU114023）

陳李鵬，男，碩士，研究方向：動(dòng)物遺傳；E-mail：clpshanxi@126.com

黃勇富，男，研究員，研究方向：動(dòng)物遺傳多樣性、遺傳資源評(píng)價(jià)與創(chuàng)新利用；E-mail：hyf65@163.com