盧詩瑤孫立潔，袁麗霞，朱薇薇姚建銘

（1.中國科學(xué)院等離子體物理研究所，合肥 230031；2.武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司，武漢 430075）

納他霉素在納塔爾鏈霉菌中的合成及其調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

盧詩瑤1孫立潔1，2袁麗霞1，2朱薇薇2姚建銘1

（1.中國科學(xué)院等離子體物理研究所，合肥 230031；2.武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司，武漢 430075）

納他霉素作為一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是納塔爾鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物。它不僅能夠有效地抑制真菌的生長，還能夠抑制黃曲霉毒素的形成，因而廣泛應(yīng)用于食品防腐劑和真菌角膜炎的治療等領(lǐng)域。納他霉素首先由乙酸激活聚酮合酶（PKS）催化合成納他霉素的骨架環(huán)，再由系列相關(guān)合成酶對(duì)其進(jìn)行加工修飾，此過程涉及系列基因簇的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)、途徑特異性調(diào)節(jié)、總體調(diào)控、交叉調(diào)節(jié)及胞內(nèi)ROS調(diào)節(jié)等。完整的納他霉素分子形成后由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)子運(yùn)出胞外。結(jié)合納他霉素的研究進(jìn)展，對(duì)其未來的研究方向進(jìn)行了展望。

納他霉素；納塔爾鏈霉菌；聚酮合成酶（PKS）；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子

納他霉素是一種多烯類大環(huán)內(nèi)酯抗生素（圖1），是一種抗菌范圍廣、效率高的真菌抑制劑，主要由恰塔努加鏈霉菌（Streptomyces chmanovgensis）、褐黃孢鏈霉菌（Streptomyces gilvosporeus）和納塔爾鏈霉菌（Streptoyces natalensis）等發(fā)酵合成［1］。它不僅能夠與膜上麥角固醇發(fā)生特異性作用來抑制真菌的生長［2］，還能夠有效地抑制黃曲霉毒素的形成。由于對(duì)動(dòng)物細(xì)胞毒性較低［3］，廣泛應(yīng)用于食品防腐劑和真菌角膜炎的治療等領(lǐng)域［4］。

納他霉素主要在納塔爾鏈霉菌生長的穩(wěn)定期中合成。在此期間，若某種營養(yǎng)素缺乏或受到其他環(huán)境信號(hào)的刺激，特異性調(diào)節(jié)子和總體調(diào)節(jié)子會(huì)被激活，從而通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)或總體交互作用來激活納他霉素合成基因簇的表達(dá)［5］。

圖1 納他霉素的分子結(jié)構(gòu)

1 納他霉素在納塔爾鏈霉菌中的合成

1.1 參與納他霉素合成的基因簇

20 00年，Aparicio等［6］已經(jīng)基本完成了對(duì)參與納他霉素合成的基因測(cè)序，目前已知該序列共有19個(gè)基因，橫跨約100 kb。在納他霉素的合成過程中，首先由pimS0-pimS4編碼的I類聚酮合成酶（polyketidesynthase，PKS）合成納他霉素骨架環(huán)；再由pimC、pim G、pimD、pimJ、pimK和pimI編碼的附加蛋白逐步對(duì)納他霉素骨架環(huán)進(jìn)行加工修飾；最后由pimA、pimB和pimH編碼的蛋白將完整的納他霉素轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞；而pimE、pimM和pimR則編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，負(fù)責(zé)調(diào)控納他霉素合成基因的表達(dá)（圖2）。

圖2 合成納他霉素的基因簇［6］

1.2 納他霉素骨架環(huán)的構(gòu)成

納他霉素大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的合成是由I類PKS催化的，PKS包括13個(gè)同源的模塊，這些模塊分布在5個(gè)由pimS0-pimS4編碼的大的多功能酶PIMS0-PIMS4中。如表1所示，PIMS0由起始模塊和模塊0組成；PIMS1包括4個(gè)模塊，模塊1-4；PIMS2包括模塊5-10；PIMS3和PIMS4分別由模塊11和12構(gòu)成。骨架環(huán)的合成由PIMS0催化起始，它的結(jié)構(gòu)為CoA連接酶-ACP-KS-AT-ACP。合成開始時(shí)，CoA連接酶結(jié)構(gòu)域催化乙酸鹽形成?；佘账?，再由ACP結(jié)構(gòu)域?qū)⑵滢D(zhuǎn)移到相鄰的KS結(jié)構(gòu)域，KS會(huì)將生長的聚酮化合物鏈轉(zhuǎn)移到C端ACP上，為PimS1模塊1的KS提供乙酰單位，作為延長的第一步［7］。

合成起始后，PIMS1的4個(gè)模塊分別完成骨架鏈延長的前4個(gè)循環(huán)，并構(gòu)成大部分的多烯發(fā)色團(tuán)。當(dāng)4個(gè)延伸步驟完成后，骨架鏈將轉(zhuǎn)移到PIMS2上繼續(xù)合成，PIMS2、PIMS3、PIMS4的8個(gè)模塊依次催化8個(gè)羧酸基本成分的結(jié)合，并對(duì)其進(jìn)行修飾，產(chǎn)生納他霉素骨架環(huán)。其中PIMS2的模塊9的KR是非活性的，不能將C9的酮基還原成羰基。因此，C9酮基通過和C13羧基之間的相互作用，構(gòu)成了成熟納他霉素所需的半縮酮環(huán)。最后，PIMS4 C末端的硫酯酶結(jié)構(gòu)域（TE）在絲氨酸殘基活性位點(diǎn)?；?，產(chǎn)生酰基-酶中間體，催化骨架延伸及環(huán)化的結(jié)束［8］。

1.3 納他霉素骨架環(huán)的修飾

如表2和圖3所示，納他霉素骨架環(huán)合成后，PimG催化納他霉素骨架環(huán)的C4-C5雙鍵發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)形成環(huán)外羧基，而GDP-甘露糖被PimJ、PimC催化構(gòu)成GDP放線菌糖胺，最后由PimK催化放線菌糖胺連接在4，5-去環(huán)氧納他霉素骨架環(huán)上，構(gòu)成4，5-去環(huán)氧納他霉素。

pimD失活的納塔爾鏈霉菌突變株只能合成4，5-去環(huán)氧納他霉素，這說明PimD是作為一種細(xì)胞色素P450單氧酶催化C4-C5雙鍵形成一個(gè)環(huán)氧，將4，5-去環(huán)氧納他霉素轉(zhuǎn)化成納他霉素［9，10］。這也是納他霉素合成的最后一步［11］。

表1 PKS基因簇及其相關(guān)信息

pimI還編碼一種硫酯酶，但它與pim4編碼的硫酯酶同源性很差。因此，這兩種酶來源不同。后來發(fā)現(xiàn)，這兩種酶的作用也不同，PimI代表了Ⅱ型硫酯酶，參與從聚酮化合物中除去非生產(chǎn)性脫羧基延長酰基，促進(jìn)產(chǎn)物的正確積累［12］。

1.4 納他霉素的轉(zhuǎn)運(yùn)

完整的納他霉素形成后，由PimA、PimB所編碼的ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)子負(fù)責(zé)將其運(yùn)出胞外［13］。pimH基因位于納他霉素合成基因簇的最右端，由于其編碼蛋白與恥垢分枝桿菌乙胺丁醇抗性區(qū)域的膜蛋白Orf4有36%的同源性，Aparicio等［6］據(jù)此推測(cè)，它也可能編碼一種流出泵參與納他霉素的轉(zhuǎn)運(yùn)。近年來，人們發(fā)現(xiàn)nysH、nysG（pimA、pimB的同源基因）失活的諾爾斯鏈霉菌突變體也可將制霉菌素運(yùn)出胞外，證明鏈霉菌中存在除ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子外的其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，從而大大提高了PimH參與轉(zhuǎn)運(yùn)納他霉素的可信度（表2）。

表2 與納他霉素合成相關(guān)的基因所編碼蛋白的功能說明

2 納他霉素合成的調(diào)控機(jī)制

納他霉素合成的調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括途徑特異性調(diào)控和總體調(diào)控等類型。途徑特異性調(diào)控基因位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的最底端，通過激活相關(guān)基因簇的表達(dá)調(diào)節(jié)納他霉素的合成。而總體多效調(diào)控基因一般不與納他霉素合成基因簇聯(lián)系在一起，它們可以對(duì)多種營養(yǎng)與環(huán)境壓力作出應(yīng)答，調(diào)控多個(gè)代謝途徑［14，15］。

圖3 納他霉素骨架環(huán)的加工修飾過程

2.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)

PimR和PimM是由納他霉素基因簇編碼的兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，其編碼基因pimR和pimM位于納他霉素合成基因簇的最左端［16］。PimR屬于鏈霉菌抗生素調(diào)節(jié)蛋白（streptomyces antibiotic regulatory proteins，SARPs）型調(diào)節(jié)子，是一種途徑特異性調(diào)節(jié)蛋白，它的N端有SARP樣結(jié)構(gòu)域，C端有鳥苷酸環(huán)化酶的半同源結(jié)構(gòu)域和一個(gè)LuxR家族的大的ATP結(jié)合調(diào)節(jié)子［17］。PimM是一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，其N端含PAS結(jié)構(gòu)域，C端含LuxR HTH模體［18］，其中LuxR是一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而PAS結(jié)構(gòu)域是一個(gè)感應(yīng)結(jié)構(gòu)域，會(huì)限制DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浒袉?dòng)子的親和力［19，20］。

pimM失活的納塔爾鏈霉菌突變體不能產(chǎn)生納他霉素，而在納塔爾鏈霉菌野生型中擴(kuò)增pimM會(huì)大大提高納他霉素產(chǎn)量。因此，PimM是納他霉素合成的激活子。Santos-Aberturas等［21］用RT-PCR和電泳遷移率分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PimR通過調(diào)節(jié)PimM來調(diào)節(jié)納他霉素的合成。PimR作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子直接結(jié)合于pimM與pimR的整合區(qū)域，激活pimM表達(dá)PimM蛋白，PimM結(jié)合于納他霉素合成基因pimK、pimS2S3S4、pimI、pimJ、pimAB、pimE、pimS1和pimD的啟動(dòng)子上，通過與RNA聚合酶的相互作用調(diào)控這些基因的表達(dá)。同時(shí)，PimM也激活其他分級(jí)調(diào)節(jié)子，從而調(diào)節(jié)pimC基因的表達(dá)。在這些蛋白的共同作用下，納他霉素開始合成［22］。

2.2 途徑特異性調(diào)節(jié)

途徑特異性調(diào)節(jié)是通過一種丁內(nèi)酯受體蛋白（butyrolactone receptor protein，Brp）應(yīng)答其同源丁內(nèi)酯分子，從而激活一系列途徑特異性調(diào)節(jié)基因編碼蛋白，這些蛋白被統(tǒng)稱為鏈霉菌抗生素調(diào)控蛋白家族［25，26］。

2.2.1 PI因子的調(diào)節(jié)作用 Recio等［27］發(fā)現(xiàn)，在納塔爾鏈霉菌中存在一種新型的群體感應(yīng)自誘導(dǎo)子（PI因子），它是一種納他霉素誘導(dǎo)子（圖4），在微摩爾濃度下即可誘導(dǎo)不產(chǎn)納他霉素的突變體合成納他霉素。據(jù)推測(cè)，PI因子的這種誘導(dǎo)作用可能是由γ-丁內(nèi)酯型受體介導(dǎo)的［28］。

圖4 PI（2，3-二氨基-2，3-雙（羥甲基）-1，4-丁二醇）的分子結(jié)構(gòu)

后來，Vicente等［29］研究發(fā)現(xiàn)，PI因子可以誘導(dǎo)pimT基因的表達(dá)，而pimT失活的納塔爾鏈霉菌突變體中PI因子的表達(dá)水平降低了50%，納他霉素產(chǎn)量降低了65%。由此可見，PimT是PI因子的轉(zhuǎn)運(yùn)子，細(xì)胞在營養(yǎng)限制等條件下產(chǎn)生PI因子，隨后被PimT轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，作為識(shí)別其他細(xì)胞的一種信號(hào)分子，其他菌株整合這種外來群體信號(hào)后，納他霉素基因開始表達(dá)。

2.2.2 甘油、乙二醇、1，2或1，3-丙二醇的調(diào)節(jié)作用 除PI因子外，甘油、乙二醇、1，2或1，3-丙二醇也可以作為納他霉素合成的誘導(dǎo)因子或前體，誘導(dǎo)并提高納他霉素的合成［30］。后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們與PI誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)機(jī)制不同，也不是PI因子的直接前體。據(jù)Li等［31］分析，這些物質(zhì)能提高納他霉素的產(chǎn)量的原因有兩種，一是丙醇作為前體，為納他霉素大環(huán)內(nèi)酯的合成提供了三碳單元；二是丙醇通過調(diào)節(jié)代謝的關(guān)鍵位點(diǎn)，使乙酰輔酶A的積累，并抑制了TCA循環(huán)、糖酵解途徑，以此促進(jìn)納他霉素的合成。

2.2.3 膽固醇氧化酶的調(diào)節(jié)作用 pimE基因位于納他霉素基因簇的中間，它是一種胞外型膽固醇氧化酶，對(duì)菌株的生長、分化沒有影響［23］。Mendes等［24］發(fā)現(xiàn)，pimE失活的菌株不能產(chǎn)生納他霉素，而基因互補(bǔ)卻恢復(fù)了納他霉素的合成，證明PimE是納他霉素合成的一種信號(hào)蛋白。據(jù)此推測(cè)，PimE與其他膽固醇氧化酶可能作為一種真菌傳感器作用于麥角固醇（真菌細(xì)胞膜中主要的固醇類物質(zhì)）并引起細(xì)胞應(yīng)答，再通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)納他霉素的合成。

2.3 總體調(diào)控

總體調(diào)控主要是通過雙組分系統(tǒng)來應(yīng)答一系列外部壓力信號(hào)，從而調(diào)控次級(jí)代謝過程。培養(yǎng)基中磷酸的濃度對(duì)納塔爾鏈霉菌的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝均產(chǎn)生極大的影響，磷酸濃度會(huì)干擾一系列基因的表達(dá)，關(guān)系到鏈霉菌由初級(jí)代謝向次級(jí)代謝的轉(zhuǎn)變［32，33］。當(dāng)培養(yǎng)基中無機(jī)磷酸鹽濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí)，納他霉素產(chǎn)量急劇下降；10 mmol/L時(shí)，所有納他霉素合成基因的表達(dá)都處于抑制狀態(tài)。Mendes等［35］克隆并測(cè)序了phoU-phoR-phoP 基因簇編碼的PhoR-PhoP雙組分系統(tǒng)，構(gòu)建了phoP 缺失突變體及phoR-phoP 缺失突變體，二者都降低了對(duì)磷酸的敏感性，并且納他霉素產(chǎn)量都增加了80%。對(duì)上述兩種突變體進(jìn)行PT-PCR及功能分析，結(jié)果表明，磷酸對(duì)納他霉素合成的調(diào)控是通過phoR-phoP修飾其他合成基因介導(dǎo)的。Rodríguez等［34］也提出，鏈霉菌中的雙組分系統(tǒng)是調(diào)節(jié)抗生素復(fù)雜代謝途徑中的關(guān)鍵。

PhoR蛋白是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的跨膜傳感激酶，它僅含有一個(gè)完整的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)額外的短的疏水尾部，可以感應(yīng)外部信號(hào)。PhoP是OmpR家族的一類DNA結(jié)合應(yīng)答調(diào)節(jié)子，其C端含有DNA結(jié)合域［36］。phoU-phoR-phoP 基因位于納他霉素合成基因簇之外，PhoP檢測(cè)到外部磷酸信號(hào)時(shí)會(huì)結(jié)合于phoU-phoR整合區(qū)域啟動(dòng)子-35區(qū)域附近的PHO盒（PhoP結(jié)合序列）上，并通過招募RNA聚合酶及穩(wěn)定RNA聚合酶-DNA啟動(dòng)子復(fù)合物進(jìn)行自調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)phoU-phoR基因大量轉(zhuǎn)錄，隨后PhoP通過一些途徑特異性調(diào)節(jié)子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生磷酸化和去磷酸化，抑制納他霉素合成基因pimS1、pimS4、pimC和pimG的表達(dá)，導(dǎo)致納他霉素產(chǎn)物的減少［35］。

2.4 交叉調(diào)節(jié)

在鏈霉菌代謝中，某些營養(yǎng)限制信號(hào)，如磷酸［37］、氮源［38］、葡萄糖或其他容易利用的碳源［39］，通過轉(zhuǎn)換成總體調(diào)節(jié)子，激活途徑特異性調(diào)節(jié)子來調(diào)控納他霉素合成的初級(jí)和次級(jí)代謝過程。Borodina等［40］研究發(fā)現(xiàn)，磷酸果糖激酶基因在調(diào)控天藍(lán)色鏈霉菌的次級(jí)代謝中發(fā)揮重要作用，而這種酶又是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶。因此，糖酵解過程中的磷酸化中間產(chǎn)物可能作為碳調(diào)控和磷酸調(diào)控的整合分子將兩種信號(hào)途徑串聯(lián)起來。

在磷酸饑餓或氮饑餓引起細(xì)胞初級(jí)代謝不平衡的情況下，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)答機(jī)制去清除過剩的營養(yǎng)，并產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物。它們之間的交互作用較為復(fù)雜，不僅影響參與氮源轉(zhuǎn)運(yùn)和同化的基因的表達(dá)，還直接影響了氮源調(diào)節(jié)子的表達(dá)［41］。有研究報(bào)道，雙組分系統(tǒng)中的PhoP蛋白會(huì)結(jié)合到某些參與氮同化作用基因的啟動(dòng)子上，調(diào)控氮的代謝［42］。然而，在納塔爾鏈霉菌中碳源、氮源、磷酸之間的交叉調(diào)節(jié)機(jī)制尚不甚清楚，有待進(jìn)一步研究。

2.5 胞內(nèi)ROS的調(diào)節(jié)

眾所周知，納他霉素的產(chǎn)量在很大程度上依賴于溶解氧的水平，低濃度O2會(huì)限制菌株的生長及納他霉素的合成，而高濃度O2會(huì)誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的升高和細(xì)胞的氧化損傷。因此，適當(dāng)增加溶氧量可以提高納他霉素的產(chǎn)量［43］。2011年，Beites等［44］闡明了胞內(nèi)ROS調(diào)節(jié)納他霉素合成的機(jī)制，氧氣消耗會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多的ROS，尤其是胞內(nèi)H2O2將PimM蛋白作為直接或間接靶標(biāo)，通過氧化還原機(jī)制調(diào)控并提高納他霉素的合成。然而，當(dāng)胞內(nèi)H2O2超過某個(gè)閾值時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，降低納他霉素的產(chǎn)量。2013年，Tiago等［45］發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)NADPH/NADH比例和通過BACC（支鏈氨基酸）代謝的生物合成的前體細(xì)胞的有效性是氧化應(yīng)激條件下納他霉素合成的重要影響因素。

3 展望

提高納他霉素產(chǎn)量一直是微生物發(fā)酵產(chǎn)納他霉素研究的核心內(nèi)容。目前，國內(nèi)主要采用誘變技術(shù)進(jìn)行菌株選育，這在一定程度上可以提高納他霉素的產(chǎn)量，但增幅程度受到該技術(shù)自身局限性的限制。研究納他霉素的合成及其分子調(diào)控機(jī)制，為傳統(tǒng)誘變技術(shù)向基因工程技術(shù)過渡奠定了理論基礎(chǔ)?；蚬こ碳夹g(shù)能夠有目的地對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行定向改造，不僅從源頭上提高納他霉素基因的表達(dá)水平及其產(chǎn)量，還可降低誘變技術(shù)的盲目性和隨機(jī)性。因此，基因工程菌種技術(shù)很可能代表納他霉素未來的研究和開發(fā)方向。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on the Biosynthetic and Regulatory Mechanisms of Natamycin in Streptomyces natalensis

LU Shi-yao1SUN Li-jie1，2YUAN Li-xia1，2ZHU Wei-wei2YAO Jian-ming1
（1. Institute of Plasma Physics，Chinese Academy of Sciences，Hefei 230031；2. Wuhan Zhongke Optics Valley Green Biotechnology Co.，Ltd.，Wuhan 430075）

Natamycin，a polyene-macrolide antibiotic，is a secondary metabolite produced by Streptomyces natalensis. It can not only effectively inhibit the growth of fungi，but also depress the generation of aflatoxin. Thus，it is widely used in the fields such as food preservatives，remedial reagent of fungal keratitis，etc. Skeleton ring of natamycin is firstly synthesized by the catalyst of acetic acid-activated polyketone synthase，and then modified by some other correlated synthases，involving the regulation and expression mechanisms of natamycin biosynthesis-related genes（i.e.，transcriptional regulator’s regulation，pathway-specific regulation，global regulation，and cross-talk regulation，as well as ROS regulation，etc）. A matured molecule of natamycin can be exported out of cells through intracellular transporters. Finally，perspective in the future has been proposed based on the research progress of latest reports.

natamycin；Streptoyces natalensis；polyketone synthase（PKS）；transcriptional regulators

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.004

2015-08-04

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）（2014AA021703），留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金［教外司留（2013）693號(hào)］，安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（1508085MB3），湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BGD019）

盧詩瑤，女，博士研究生，研究方向：納他霉素的合成工藝與改良；E-mail：lushiyao2015@163.com

孫立潔，副研究員，E-mail：ljsun@ipp.ac.cn；姚建銘，研究員，E-mail：jmyao@ipp.ac.cn