蔡曉琴， 顧霞敏， 唐小琴， 金 倩， 詹艷麗

(臺州學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，浙江臺州 318000)

合歡花總黃酮含量的測定及其超聲提取工藝研究

蔡曉琴， 顧霞敏*， 唐小琴， 金 倩， 詹艷麗

(臺州學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，浙江臺州 318000)

摘要[目的]提取并測定合歡花中總黃酮。[方法]采用AlCl3-甲醇顯色-紫外分光光度法測定合歡花中總黃酮的含量，并以總黃酮提取率為指標，通過正交試驗優(yōu)化合歡花中黃酮類化合物的超聲提取工藝。[結(jié)果]確定紫外檢測波長為434 nm，精密度、重復(fù)性的RSD分別為0.96%、1.46%，加樣回收率為99.6%。超聲提取最佳工藝參數(shù)為料液比1∶30(g∶mL)、乙醇體積分數(shù)80%、溫度60 ℃、提取2次，在此條件下總黃酮提取率為2.94%。[結(jié)論]該方法可為進一步開發(fā)合歡花資源提供一定的參考。

關(guān)鍵詞合歡花；總黃酮；測定；超聲提取法；工藝

合歡花為豆科植物合歡(Albiziajulibrissindurazz)的干燥花序或花蕾，主要含有揮發(fā)性成分[1]、多糖[2]和黃酮類化合物[3]等。研究發(fā)現(xiàn)，合歡花黃酮類化合物具有抗抑郁、抗焦慮等作用[4-5]，合歡花為一些治療抑郁癥方劑中的主藥。目前，關(guān)于合歡花總黃酮的提取和含量測定研究較少。國內(nèi)外研究主要采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[6]和AlCl3-甲醇顯色法[7-8]2種紫外分光光度法測定總黃酮的含量，前者需要依次加入3種試劑，顯色時間共為27 min；而后者加入1種試劑，顯色時間為15 min，可見AlCl3-甲醇顯色法更簡便。該試驗采用AlCl3-甲醇顯色-紫外分光光度法測定合歡花中總黃酮的含量，并以總黃酮提取率為指標，通過正交試驗優(yōu)化合歡花中黃酮類化合物的超聲提取工藝，為合歡花資源的充分利用提供一定的依據(jù)。

1材料與方法

1.1試材合歡花，購自浙江省椒江市阜大藥店；蘆丁標準品(批號100080-201409；來自中國藥品食品檢定研究院)；甲醇、乙醇、石油醚(60～90 ℃)、AlCl3·6H2O，均為分析純。

1.2儀器UV-2401PC島津紫外分光光度計(日本島津公司)，F(xiàn)W177中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，JN-3200DT型超聲波清洗機(寧波江南儀器廠)，SHZ-ⅢB型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.3方法

1.3.1溶液的配制。

1.3.1.1蘆丁標準溶液的制備。精密稱取蘆丁10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即為1 mg/mL的蘆丁標準溶液。

1.3.1.2樣品溶液的制備。合歡花干燥、粉碎，過60目篩子。取1.0 g合歡花粉末于具塞錐形瓶中，加入60%乙醇30 mL，60 ℃下超聲提取40 min。抽濾，濾液用石油醚萃取，取下層液體，減壓濃縮至浸膏狀，用甲醇溶解并定容至25 mL。

1.3.2檢測波長的確定。分別移取1 mL的蘆丁標準溶液和樣品溶液于10 mL容量瓶中，加入1%AlCl3-甲醇溶液4 mL，用甲醇稀釋至刻度[8]，搖勻、顯色15 min。同法以甲醇制得空白溶液，在200～600 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。根據(jù)吸收譜圖，確定最佳顯色波長。

1.3.3方法學(xué)考察。

1.3.3.1線性關(guān)系的考察。將蘆丁標準溶液用甲醇稀釋成濃度為0.004～0.100 mg/mL的系列濃度標準溶液。同“1.3.2”進行顯色，在確定的檢測波長下，用紫外分光光度計測定吸光度。以標準液濃度(X)為橫坐標、吸光度(Y)為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3.2精密度試驗。取“1.3.1.2”制備的樣品溶液6份，分別進行顯色，測定吸光度，計算RSD。

1.3.3.3穩(wěn)定性試驗。取1 mL樣品溶液，顯色15 min后，分別測定0～40 min(間隔2 min)內(nèi)吸光度的變化并計算RSD。

1.3.3.4重復(fù)性試驗。取合歡花粉末6份，按照“1.3.1.2”的方法制備樣品溶液，分別取樣分析，測定吸光度，計算RSD。

1.3.3.5加樣回收率試驗。取5份同一樣品溶液各1 mL，分別加入0.02 mg/mL的蘆丁標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別測定加樣前后吸光度變化，計算溶液中總黃酮的含量、加樣回收率和RSD。

1.3.4合歡花總黃酮提取工藝的優(yōu)化。

1.3.4.1正交試驗。參考文獻[9-10]和根據(jù)前期試驗，以乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、提取溫度(C)進行三因素三水平正交試驗(表1)，優(yōu)化合歡花總黃酮提取工藝。具體操作為：稱取1.0 g合歡花粉末于具塞錐形瓶中，根據(jù)因素水平表(表1)，加入一定量的試劑，超聲提取40 min。提取液用石油醚萃取，取下層液體，減壓濃縮除去溶劑，用甲醇溶解并定容至25 mL，即為提取液。以提取率為指標，確定提取的乙醇體積分數(shù)、料液比和提取溫度。

表1　正交因素水平

1.3.4.2提取次數(shù)的考察。在正交試驗確定的工藝條件下，提取1、2、3、4、5次，計算合歡花中總黃酮的提取率，確定最佳提取次數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1合歡花總黃酮含量的測定

2.1.1檢測波長的選擇。由圖1可知，樣品溶液與標準溶液在210、273和434 nm 處有吸收峰。由于434 nm干擾較小，因此確定檢測波長為434 nm。

注：1為蘆丁標準溶液；2為樣品溶液。Note: 1. Rutin standard solution; 2. Sample solution. 圖1 蘆丁與樣品溶液吸收譜圖Fig. 1　Absorption spectra of rutin and sample solution

2.1.2線性關(guān)系的考察。按“1.3.3.1”方法操作，以蘆丁標準液濃度(X)為橫坐標、吸光度(Y)為縱坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程為Y=3.445 6X-0.011 7(R2=0.997 3)，說明該方法在蘆丁濃度0.004～0.100 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度試驗。按“1.3.3.2”方法操作，測定6份樣品平行溶液的吸光度，計算得RSD=0.96%，表明該方法精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗。按“1.3.3.3”方法操作，計算30 min吸光度RSD為0.70%，40 min內(nèi)RSD為1.04%，表明該顯色方法至少在40 min內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.1.5重復(fù)性試驗。按“1.3.3.4”方法操作，計算得平均提取率為2.49%，RSD=1.46%(n=6)，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6加樣回收率試驗。按“1.3.3.5”方法操作，計算得加樣回收率為98.3%～101.0%，平均回收率為99.6%，RSD=1.31%，滿足分析測定的需要。

2.2合歡花總黃酮超聲提取工藝的優(yōu)化

2.2.1正交試驗。以乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、提取溫度(C)進行正交試驗，平行操作3次。由表2可知，影響合歡花總黃酮提取的主次順序依次為乙醇體積分數(shù)(A)、提取溫度(C)、料液比(B)；最佳方案為A3B1C3，即乙醇體積分數(shù)80%、料液比1∶30(g∶mL)、提取溫度60 ℃，為正交試驗中第7組試驗，平均提取率為2.85%，高于其他8組試驗，證明該條件為最佳選擇。

表2　正交試驗結(jié)果

2.2.2提取次數(shù)的確定。在“2.2.1”的最佳條件下，提取1～5次。由圖2可知，增加提取次數(shù)可以增加提取率，但提取2次后，隨著提取次數(shù)的增加，提取率的增加幅度不大，從經(jīng)濟效益考慮，確定提取次數(shù)為2次，相應(yīng)提取率為2.94%。

圖2　提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響Fig.2　Effects of extraction times on the extraction rate of total flavonoids

3結(jié)論

該研究采用AlCl3-甲醇顯色-紫外分光光度法測定合歡花中總黃酮的含量，并以總黃酮提取率為指標，通過正交試驗優(yōu)化合歡花中黃酮類化合物的超聲提取工藝。結(jié)果表明，確定紫外檢測波長為434 nm，精密度、重復(fù)性的RSD分別為0.96%、1.46%，加樣回收率為99.6%。合歡花總黃酮超聲提取最佳工藝參數(shù)為料液比1∶30(g∶mL)、乙醇體積分數(shù)80%、溫度60 ℃、提取2次，在此條件下總黃酮提取率為2.94%。該方法簡單、快速、準確，適合于合歡花總黃酮含量的測定，可為進一步開發(fā)合歡花資源提供一定的參考。

參考文獻

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Determination and Ultrasonic Extraction of Total Flavonoids from the Flowers ofAlbiziajulibrissindurazz

CAI Xiao-qin, GU Xia-min*, TANG Xiao-qin et al

(School of Pharmaceutical and Chemical Engineering, Taizhou University, Taizhou, Zhejiang 318000)

Abstract[Objective] To extract and detect the total flavonoids from the flowers of Albizia julibrissin durazz. [Method] The content of total flavonoids in A. julibrissin was determined by AlCl3-methanol color development-UV spectrophotometry. With the extraction rate of total flavonoids as the index, ultrasonic extraction technology of flavonoids from A. julibrissin was optimized by orthogonal test. [Result] The detection wavelength was 434 nm. The RSDs of precision and reproducibility tests were 0.96% and 1.46%, respectively. The average recovery rate was 99.6%. The optimal extraction technology was 1∶30(g∶mL) solid-liquid ratio, 80% ethanol volume fraction, 60 ℃ extraction temperature and 2 extraction times. Under this condition, the extraction rate of total flavonoids from the flowers of A. julibrissin was 2.94%. [Conclusion] This research provides references for the further development of A. julibrissin flowers.

Key wordsFlowers of Albizia julibrissin durazz; Total flavonoids; Determination; Ultrasonic extraction; Technology

基金項目臺州學(xué)院校立青年基金項目(2013QN18)。

作者簡介蔡曉琴(1995- )，女，浙江建德人，本科生，專業(yè)：制藥工程。*通訊作者，講師，碩士，從事天然產(chǎn)物的提取與分析研究。

收稿日期2016-03-08

中圖分類號S 509.9;R 284.2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-151-03