陳建霞，許瑞環(huán)，黃衍鋒，張　旭

(深圳市龍崗中心醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518116)

·論著·

3種不同方法檢測乙型肝炎病毒的診斷性能比較

陳建霞，許瑞環(huán)，黃衍鋒，張旭

(深圳市龍崗中心醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518116)

摘要:目的比較酶聯(lián)免疫法(ELISA)、電化學發(fā)光法(ECLIA)及聚合酶鏈式反應法(PCR)檢測乙型肝炎病毒(HBV)對臨床診斷的對比分析。方法應用ELISA、ECLIA及PCR法同時檢測200例HBV患者或HBV攜帶者血清標本的HBV病毒，比較不同方法HBV病毒檢出率差異。結果ELISA對HBV病毒有5份漏檢，而PCR、ECLIA沒有。PCR、ECLIA和ELISA方法對HBV的檢測結果與臨床符合率分別為99.5%、100.0%及93.5%。HBV-DNA的檢測結果與ECLIA法檢測HBV病毒一致性較好。結論ELISA分別與ECLIA及PCR檢測HBV病毒的檢出率有顯著性差異，ELISA比較適合初篩，ECLIA相對準確性更好一些，而PCR檢測HBV-DNA用于判斷體內HBV病毒復制與否。

關鍵詞:乙型肝炎病毒；酶聯(lián)免疫法；電化學發(fā)光法；聚合酶鏈式反應法

隨著免疫學和分子生物技術的迅速發(fā)展，檢測乙型肝炎病毒(HBV)標志物的方法不斷更新[1]。目前常用的免疫學方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，固相放射免疫法、膠體金免疫層析法、時間分辨免疫熒光法、微粒子酶免疫分析法、化學發(fā)光法及電化學發(fā)光法(ECLIA)等[2]，分子生物學方法有聚合酶鏈式反應法(PCR)。放射免疫分析雖然具有高靈敏度的優(yōu)點，但其不可避免的放射性對操作者的身體是有害的。膠體金法是一種優(yōu)化的方法，其優(yōu)點是速度快，10 min即可判讀結果，但其同樣只能做定性檢測，且準確率低于ELISA，對于弱陽性的表現度較差，容易造成弱陽性標本的漏讀和誤讀，性價比與準確度方面都略遜于傳統(tǒng)的ELISA[3]。時間分辨免疫熒光法、微粒子酶免疫分析法、化學發(fā)光法及ECLIA是目前定量檢測HBV標記物的較好方法[4]。這些方法具有很多優(yōu)越性，如靈敏度和特異性都比定性方法學高，標本可以獨立檢測，大大縮短了等候報告的時間等；另外定量方法可以克服ELISA定性對含量太高造成假陰性的誤判，也避免了ELISA 定性分析時弱陽性標本的漏檢[5]。HBV病毒核酸(HBV-DNA)水平是直接反映HBV患者病毒復制水平，病毒血癥程度，傳染性強弱的最佳指標，目前臨床上常采用熒光定量PCR可直接檢測血清中HBV-DNA的載量。由于ELISA、ECLIA及PCR方法在臨床檢測中應用的比較多，本文旨在研究三者之間的關系，為對乙型肝炎的診斷與治療提供更準確、更有價值的信息。

1資料與方法

1.1一般資料隨機留取本院HBV患者或HBV攜帶者血清樣本200例，其中男135例，女65例，平均年齡47歲。入選標準：HBsAg陽性持續(xù)6個月以上；ALT<2×ULN持續(xù)6個月以上，未使用任何保肝降酶藥；HBeAg(+/-)，HBV-DNA>102copies/mL；既往未接受任何抗病毒治療包括干擾素和核苷(酸)類似物，排除其他類型肝炎的感染。按照HBV-DNA含量高低分3組。 A組為HBV-DNA含量小于103copies/mL；B組為HBV-DNA含量103～<105copies/mL；C組為HBV-DNA含量 105～108copies/mL；每組份HBV血清標志物的測定采用同一份標本。

1.2主要儀器與試劑全自動發(fā)光儀(美國羅氏公司生產的E170型)、實時熒光PCR分析儀(美國ABI公司生產7300型)、酶標儀(上海安圖公司生產PHOM型)和洗板機(深圳匯松洗板機PW-960)。PCR法試劑由深圳市匹基生物科技有限公司提供；HBV血清學標志物發(fā)光試劑是美國羅氏公司配套試劑，ELISA法試劑由上?？迫A公司提供。

1.3檢測方法

1.3.1標本采集空腹抽取靜脈血3 mL，避免溶血和脂血。靜置30 min,，2 000 r/min離心5 min，離心后分離血清，-80 ℃保存直至檢測。

1.3.2HBV血清標志物檢測分別采用ECLIA法和ELISA法，ECLIA法由美國羅氏公司提供全自動免疫分析儀和配套試劑。ELISA法由上?？迫A公司提供試劑。每天質量控制均符合要求，操作與判斷結果嚴格按照說明書要求進行。

1.3.3HBV-DNA檢測采用實時熒光定量PCR儀(循環(huán)程序設置：50 ℃，2 min，1個循環(huán)；94 ℃，5 min，1個循環(huán)；94 ℃，15 s，57 ℃，15 s，45個循環(huán)；25 ℃，10 s，1個循環(huán)。熒光信號收集在57 ℃。HBV-DNA定量結果由儀器軟件自動分析計算，HBV-DNA>103copies/mL時血清為陽性。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，HBV-DNA copies數采用求對數平均值的方法計算，并運用χ2檢驗和Fisher精確檢驗比較檢測結果，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.13種方法檢出率的頻數分布研究結果顯示，ECLIA檢測的HBsAg陽性檢出率與ELISA檢測的陽性率比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他組間ELISA組與PCR組(χ2=2.065，P=0.091)或ECLIA組與PCR組(χ2=2.008，P=0.157)其檢出率差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對于陰性檢出率ELISA組與ECLIA或PCR比較(χ2=6.231，P=0.013)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　　3種方法檢測HBV標志物檢出率的頻數分布

2.23種方法檢測HBV標志物定量結果比較總體上組內差異情況研究結果顯示，ECLIA檢測的HBsAg或PCR法檢測的HBV-DNA在A和C組內存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其他組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在ELISA組的檢出率中C組與A和B組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，A和B組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2　　3種方法檢測HBV標志物分組結果定量結果比較

2.3ELISA,ECLIA和PCR檢測HBV標志物檢出率比較3種方法對HBV標志物檢出率兩兩之間進行比較，方法采用Fisher精確檢驗，結果顯示ELISA法檢出率(93.5%)與ECLIA法(100.0%)和PCR法(100.0%)檢出率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ECLIA法與PCR法檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3討論

本試驗結果顯示PCR和ECLIA檢測的HBV結果比ELISA對臨床診斷的符合率較高，但是每種方法對HBV的檢測又各有差異。

ELISA仍是目前大多數臨床實驗室定性檢測HBV血清標志物的常規(guī)方法。該方法具有靈敏度高、特異度強、重復性好的特點，且操作簡單、試劑價廉、無放射性危害等多年來廣泛應用于臨床[6-7]。然而，ELISA不能進行定量分析，在陽性判斷值周圍一定范圍之外的測定結果為測定的灰區(qū)，易引起假陰性。本試驗結果表明，5例ELISA檢測陰性的標本ECLIA檢測或PCR檢測為陽性，分析其原因可能為溶血、脂血、黃疸鉤狀效應引起的[8]。雖然ELISA 方法優(yōu)缺點分明，但從臨床角度，尚不可能用ECLIA或時間分辨熒光分析法來取代傳統(tǒng)的ELISA，其原因主要在于價格上的巨大差異。而且，絕大多數受試者只需ELISA即可，而且ELISA中S/CO值實際上有一定半定量意義。

ECLIA是一種高靈敏度的分析技術，是繼放射免疫、熒光免疫、酶免疫、化學發(fā)光免疫和時間分辨免疫技術測定之后新一代標記技術。近年來，ECLIA以其自動、快速、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點展現出良好的應用前景[9]。本試驗結果顯示ECLIA的檢測陽性率和符合率均高于ELISA檢測方法。有研究結果顯示ECLIA的靈敏度為0.05 ng/mL，大大高于ELISA測定靈敏度的1.00 ng/mL[10]。從方法學和自動化程度上來講，ECLIA優(yōu)于ELISA，但成本高，且未能國產化，從而影響到其推廣應用。ECLIA和ELISA不能定量判斷病毒載量情況，PCR方法在此方面要優(yōu)于以上方法。 PCR技術能夠大大增加HBV-DNA檢測的敏感范圍，達到5～10 pg/mL[11]。而且PCR檢測HBV-DNA可以判斷體內HBV是否存在復制、復制程度、HBV是否被清除等，特別是檢測隱性HBV方面尤為突出，為臨床觀察藥物療效、病情轉歸等提供了有力的證據[12]。

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The comparision of there different methods to detect HBV virus of diagnostic performance

ChenJianxia,XuRuihuan,HuangYanfeng,ZhangXu

(DepartmentofClinicalLaboratory,LonggangCentralHospitalofShenzhen,Shenzhen,Guangdong518116,China)

Abstract:ObjectiveTo compare of ELISA,ECLIA and PCR in the detection of HBV virus for clinic diagnosis of HBV patients.MethodsThe serum sample of 200 HBV patients or HBV carriers were tested with ELISA,ECLIA and PCR.The different HBV detection rate between the three methods were compared.ResultsFive of 200 samples were lost with ELISA method,but in ECLIA and PCR there were no lost samples.Coincidence rate of HBV detection of ELISA,ECLIA and PCR were 99.5%，100.0% and 93.5% respectively.The results of HBV with ECLIA were consistent with HBV-DNA with PCR method.ConclusionThere is obvious difference between ELISA,ECLIA and PCR in relevance rate of HBV detection.ELISA is suitable to preliminary screening,and ECLIA has better accuracy and PCR is suitable to decide whether HBV virus replication happened in the body.

Key words:hepatitis B virus;ELISA;ECLIA;PCR

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.024

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)10-1360-02

(收稿日期：2015-12-11)

作者簡介：張文靜,女,副主任醫(yī)師，主要從事臨床免疫學檢驗研究。