郭振華，喬松林（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002）

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酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在規(guī)?；i場的應(yīng)用

郭振華，喬松林
（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002）

摘 要：血清學(xué)檢測在疫苗免疫效果評估、疫病診斷監(jiān)測、豬群健康評估等方面發(fā)揮著重要的作用，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測技術(shù)因其具有操作簡便、快速敏感和易于標準化等優(yōu)點，使其得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。目前ELISA檢測技術(shù)在養(yǎng)豬生產(chǎn)中已得到廣泛的認可，但如何采集合適的樣本數(shù)量、如何從檢測結(jié)果分析出需要的信息等，依然是困擾大多數(shù)從業(yè)者的問題。文章通過結(jié)合實際的臨床檢測案例，希望可以為該技術(shù)在規(guī)模化豬場的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：血清學(xué)檢測；ELISA；樣本數(shù)量；結(jié)果分析

血清學(xué)檢測，是利用抗原抗體可以發(fā)生特異性反應(yīng)而建立的一種體外檢測方法。既可以利用已知的抗原（或病原）檢測血清中對應(yīng)的抗體，也可以利用已知的抗體來捕獲血清中對應(yīng)的抗原（或病原）。血清學(xué)檢測技術(shù)包括凝集反應(yīng)（如血凝和血凝抑制試驗）、沉淀反應(yīng)（如瓊擴試驗）、標記抗體技術(shù)（如酶聯(lián)免疫吸附試驗，ELISA）、補體反應(yīng)（如補體結(jié)合試驗）［1， 2］。其中以ELISA檢測技術(shù)在規(guī)?；i場應(yīng)用的最為廣泛，但在實際工作中，筆者也發(fā)現(xiàn)在樣品采集數(shù)量、檢測結(jié)果分析及不同ELISA檢測產(chǎn)品的正確使用上，依然存在諸多問題。本文結(jié)合臨床的一些檢測案例，希望可以對以上問題做進一步的闡明，以供相關(guān)從業(yè)人員進行參考。

1 血清樣品的采集

1.1 采集數(shù)量

一般來說，對于一個群體而言，樣品采集的數(shù)量越多，越能代表或者反映整個動物群體的狀況，但同時養(yǎng)殖者也需付出較高的經(jīng)濟成本。因此，采集合適數(shù)量的樣品，既能達到血清學(xué)檢測的目的，又能最大化地降低成本，是非常重要的。采樣數(shù)量主要受檢測的目的、樣本群體大小、置信度和預(yù)估流行率（感染率）等因素的影響，如果檢測目的是評估疫苗免疫后的抗體陽性率水平，那么在置信度為95%，允許誤差在15%左右時，若預(yù)估抗體陽性率在50%以上時，樣本數(shù)量最多為43份；如果檢測目的是監(jiān)控豬群中某一疫病的感染情況，那么在置信度為95%，預(yù)估流行率為10%～20%時，則至少需要采集15份樣品來進行評估［3-4］。根據(jù)臨床檢測的經(jīng)驗，結(jié)合流行病學(xué)的相關(guān)要求，我們總結(jié)了常規(guī)的豬群血清學(xué)抗體水平評估采樣量（表1）和疫病感染情況的監(jiān)測評估采樣量（表2）。當然，在實際生產(chǎn)中也可由獸醫(yī)人員根據(jù)該場的具體情況來擬定采樣數(shù)量。

表1 規(guī)?；B(yǎng)豬場豬群抗體常規(guī)評估采樣信息參考表

1.2 樣品的保存

1.2.1 血清樣品

采血后，室溫下傾斜30°左右放置約30 min，待有黃色液體析出后，立即冷鏈發(fā)送相關(guān)機構(gòu)進行檢測；如果不能當天發(fā)送，則室溫放置2 h，然后放4～8℃冰箱保存，保存時間不得超過5 d。超過5 d，則需要丟棄樣品。對于-20 ℃保存的樣品，可以持續(xù)3個月，但要避免反復(fù)凍融。

表2 規(guī)?；B(yǎng)豬場豬群疫情監(jiān)測采樣頭份參考表

1.2.2 全血樣品

如做抗凝血處理，4～8℃可以保存7 d；如果未做抗凝血處理，建議采血后立即發(fā)送檢測單位。

1.3 檢測頻率

建議每年春秋進行兩次系統(tǒng)的豬群抗體評估；其他可根據(jù)本場豬群的健康狀況進行靈活的檢測。

2 結(jié)果的判定

ELISA檢測結(jié)果的展示，因檢測方法的不同，呈現(xiàn)的形式也不同。以愛得士（IDEXX）的相關(guān)產(chǎn)品為例，通常有阻斷率（如豬瘟抗體檢測試劑盒）、S/P值（如豬藍耳病抗體檢測試劑盒）、S/N值（如偽狂犬病抗體檢測試劑盒）。這些數(shù)值的大小在一定程度上也反映了血清中抗體或抗原（病原）水平的高低。對結(jié)果的進一步分析，主要有陽性率和變異系數(shù)（CV），其中變異系數(shù)也稱為離散度，由樣本檢測結(jié)果的標準偏差除以檢測結(jié)果的平均值而獲得，主要反映了各個檢測樣本之間檢測結(jié)果的一致性和均衡性，進而反映整個動物群體內(nèi)抗體水平的均衡性，變異系數(shù)越小，說明動物群體內(nèi)個體之間的抗體水平越接近，反之則預(yù)示著個體之間差異較大［5］。如在豬瘟抗體阻斷率的分析中，如果變異系數(shù)低于40%，則認為豬群內(nèi)個體間抗體水平較為一致，整個豬群處于基本相似的免疫狀態(tài)，如果變異系數(shù)高于60%，則預(yù)示豬群內(nèi)抗體水平極不均衡，需要采取干預(yù)措施。對于陰性和陽性結(jié)果的判定應(yīng)根據(jù)使用產(chǎn)品的說明書來進行，陽性率等于陽性樣本數(shù)除以被檢測的樣本總數(shù)。

3 ELISA檢測技術(shù)在規(guī)?；i場的應(yīng)用

3.1 評估疫苗免疫效果

根據(jù)血清學(xué)的檢測結(jié)果，通過對比免疫前和免疫后的檢測結(jié)果，可以評估某種疫苗的免疫效果。一般來說，針對滅活疫苗，通常在第二次免疫后的2～4周進行評估（如口蹄疫、圓環(huán)病毒病疫苗）；對于弱毒活疫苗，通常在免疫后的4～6周進行評估（如豬瘟、偽狂犬病疫苗）。以某規(guī)?；i場口蹄疫血清學(xué)檢測結(jié)果為例（圖1），母豬群在經(jīng)過2次基礎(chǔ)免疫后，OD值檢測在1.2以上，且陽性率達到了100%，免疫效果良好，研究顯示畜群的群體免疫力達到85%～90%便可以阻斷一次口蹄疫的流行。商品豬檢測顯示，1次免疫后的效果并不好，10周齡前抗體水平、陽性率持續(xù)下降，在10周齡經(jīng)過第2次免疫后，陽性率逐步升高，至14周齡時，陽性率達到83%，基本符合口蹄疫疫苗免疫后的抗體轉(zhuǎn)換規(guī)律。

3.2 確定合理的免疫程序

對于弱毒疫苗的免疫，如豬瘟疫苗和偽狂犬病疫苗。選擇合適的首免日齡是必要的，如果免疫過早，仔豬從母體獲得的母源抗體會干擾首次疫苗免疫產(chǎn)生的效果；如果免疫過晚，則會增加豬群的免疫空白期，增加了豬群感染的風(fēng)險。目前針對首免日齡的確定還沒有一個統(tǒng)一的衡量標準。以筆者的經(jīng)驗看，建議豬瘟在整體陽性率低于60%，或者平均阻斷率低于50%時（以愛德士的豬瘟抗體檢測試劑盒為參考）進行首次免疫是比較合適的。偽狂犬病的母源抗體通?？梢猿掷m(xù)到8～10周齡，因此常在這一階段進行免疫，同時也要參考本場商品豬偽狂犬病的感染壓力，必要時在6～8周齡進行首次免疫，間隔4周以上進行第2次的免疫。通過血清學(xué)的檢測，可以確定適合本場的首免日齡。

3.3 評估豬群的整體健康水平和對疫病的群體抵抗力

圖1 某規(guī)模化豬場口蹄疫（FMDV）血清學(xué)檢測結(jié)果（武漢科前口蹄疫抗體檢測試劑盒）

圖2 某規(guī)?；i場豬藍耳病抗體血清學(xué)檢測結(jié)果（愛德士豬藍耳病抗體檢測試劑盒）

通過血清學(xué)的檢測，結(jié)合豬群的臨床表現(xiàn)，在一定程度上可以幫助我們了解豬群的整體健康狀況和豬群對于某種疫病的抵抗能力。以某規(guī)?；i場豬藍耳病的抗體檢測結(jié)果為例（圖2）。本場母豬群免疫豬藍耳病經(jīng)典毒株VR2332，每年免疫3次，商品豬未免疫豬藍耳病疫苗，且為兩點式生產(chǎn)工藝，后備豬和母豬群S/P值在2.0左右，陽性率均大于90%，變異系數(shù)基本在40%左右，提示豬藍耳病疫苗免疫效果較好，豬藍耳病病毒在母豬群中處于一種較穩(wěn)定的狀態(tài)；商品豬8周齡之前，S/P值和陽性率在持續(xù)降低，8周齡后緩慢升高，至21周齡，S/P值達到1.5，陽性率為100%，說明商品豬經(jīng)歷了一個豬藍耳病緩慢、溫和感染的過程，現(xiàn)場查看，豬群并沒有任何臨床表現(xiàn)，因此總體來看，本場豬藍耳病處于一種陽性穩(wěn)定狀態(tài)。

3.4 疫病的診斷監(jiān)測

ELISA檢測也可以用于疫病的診斷監(jiān)測。一方面，通過大量的臨床樣本的血清學(xué)檢測，可以評估某地區(qū)某種疫病的流行感染分布情況［6-7］；另一方面通過系統(tǒng)的血清抗體檢測，可以清楚地推測出豬群在哪一個階段感染了某種病原，進而采取合適的控制策略。以某規(guī)模豬場豬偽狂犬病毒gE抗體檢測為例（圖3），該場母豬群為偽狂犬病野毒陽性，陽性率達到80%以上，在對商品豬的持續(xù)檢測中，我們發(fā)現(xiàn)豬群在9周齡以前，gE抗體陽性率持續(xù)下降，9周齡以后，陽性率上升明顯，在13周齡達到了100%，提示豬群從9周齡開始，偽狂犬病野毒逐步侵入豬群，并迅速蔓延開來。因此我們在控制該病時，應(yīng)該在5周齡到8周齡之間，用疫苗進行干預(yù)，間隔4周后進行強化免疫。

3.5 重要疫病的凈化

血清學(xué)檢測技術(shù)在疫病的凈化過程中也發(fā)揮著重要的作用。在疫病的凈化工作中，一般分為強化免疫、免疫無疫、不免無疫3個階段，在這一過程中，如何區(qū)分疫苗免疫和野毒感染是一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。美國、加拿大和歐洲一些國家，已成功完成了豬瘟、豬偽狂犬病、口蹄疫的凈化工作，針對這3種疫病的血清學(xué)檢測產(chǎn)品，可以很好地為我們開展疫病檢測凈化工作提供支撐。目前主要的產(chǎn)品有基于檢測豬瘟Erns蛋白的抗原檢測試劑盒、基于檢測偽狂犬gE蛋白抗體的檢測試劑盒、基于檢測口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的檢測試劑盒。這些產(chǎn)品可以有效地區(qū)分疫苗免疫和野毒感染狀態(tài)，也正逐漸在實際生產(chǎn)中得到較為廣泛的應(yīng)用。

圖3 某規(guī)?；i場豬偽狂犬gE抗體血清學(xué)檢測結(jié)果（愛德士檢測試劑盒）

4 小結(jié)

ELISA檢測技術(shù)具有操作簡便，耗用時間相對較短，所需設(shè)備較少，檢測結(jié)果受外界條件干擾較小，便于開展大量樣本的檢測等優(yōu)點，在動物疫病防控領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，也逐步成為養(yǎng)殖企業(yè)生產(chǎn)管理的組成部分。除了ELISA技術(shù)外，其他血清學(xué)檢測技術(shù)，如血凝和血凝抑制、瓊擴試驗、玻片凝集試驗、膠體金免疫層析等檢測技術(shù)在養(yǎng)殖領(lǐng)域也有較廣泛的應(yīng)用，特別是基于膠體金免疫層析技術(shù)開發(fā)的快速檢測試紙條，操作更為簡便、快捷，通常在10～15 min可以獲得結(jié)果，具有很好的應(yīng)用前景。在實際生產(chǎn)中，應(yīng)充分考慮檢測的目的，制訂合理的采樣方案和檢測方案，對檢測結(jié)果進行正確的分析，同時結(jié)合豬群的臨床表現(xiàn)，才能獲得有價值的信息，為生產(chǎn)實踐提供參考。

參考文獻

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基金項目：國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-36）；河南省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（S2012-06）

作者簡介：郭振華（1984-），男，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)博士，主要從事規(guī)?；i場疫病防控工作。

通訊作者：喬松林，Email：cdj565@gmail.com

收稿日期：（2016-03-07）