權(quán)效珍　蘭艷麗

441021 湖北文理學(xué)院附屬襄陽(yáng)市中心醫(yī)院

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miR-296在卵巢癌中的表達(dá)及其靶基因的預(yù)測(cè)研究

權(quán)效珍蘭艷麗

441021 湖北文理學(xué)院附屬襄陽(yáng)市中心醫(yī)院

【摘要】目的觀察miR-296在卵巢癌中的表達(dá)及其靶基因的預(yù)測(cè)。方法收集卵巢癌患者組織樣本22例和婦科活檢為正常的樣本22例，在提取RNA后進(jìn)行RNA純度檢測(cè)，進(jìn)而檢測(cè)miR-296在卵巢癌中的表達(dá)；在卵巢癌細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)入高表達(dá)miR-296的質(zhì)粒，miRNA芯片進(jìn)行靶基因檢測(cè)。結(jié)果卵巢癌組織中miR-296高表達(dá)，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。在卵巢癌細(xì)胞系中，當(dāng)高表達(dá)miR-296時(shí)，microRNA143和microRNA215在轉(zhuǎn)染組中高表達(dá)，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p低表達(dá)。結(jié)論miR-296在卵巢癌中高表達(dá)，且其潛在的靶基因有可能作為臨床卵巢癌診斷的標(biāo)志。

【關(guān)鍵詞】miR-296；卵巢癌；靶基因

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:727～729)

卵巢癌被認(rèn)為是常見惡性腫瘤中致死率較高的腫瘤疾病，特別是在東亞和南非國(guó)家中尤為常見，且在發(fā)展中國(guó)家中，卵巢癌患者發(fā)病率和死亡率也明顯要高于其他發(fā)達(dá)國(guó)家[1-2]。卵巢癌患者的發(fā)病率是一個(gè)多因素，多步驟，復(fù)雜的過程，而且和各類婦科疾病及患者身體狀況有關(guān)系[3]，但是其潛在形成惡性腫瘤的機(jī)制還未被研究清楚。microRNA被報(bào)道是一個(gè)小的非編碼RNA，它可以調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄功能，進(jìn)而促進(jìn)或者抑制腫瘤基因的表達(dá)[4]。到現(xiàn)在為止，超過1000個(gè)人類microRNA被確認(rèn)而且被報(bào)道在RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中，而且有些被用來(lái)作為診斷、預(yù)后和治療的分子生物標(biāo)記物[5-6]。miR-296位于染色體20q13.32處，有研究報(bào)道m(xù)iR-296的分子作用是與血管生成有關(guān)，是一個(gè)比較好的腫瘤抑制劑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞極性[7-8]。但是miR-296在卵巢癌中的研究較少，且關(guān)于其靶基因在卵巢癌中的研究在國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。

1材料與方法

1.1臨床資料

收集我院腫瘤科卵巢癌患者樣本22例，將婦科活檢為正常的樣本22例進(jìn)行對(duì)照，患者各類臨床資料均良好保存。

1.2方法

1.2.1Q-PCR試劑及方法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，稱取等量組織或血清，加入同等比例的Trizol，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，靜置5 min，使之充分裂解；加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，然后放置3 min；12 000 r/min，4 ℃離心15 min，離心完后分為3層，取最上層(中間一層為蛋白)至一新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒數(shù)次，室溫沉淀10 min；12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液；加入75%乙醇(DEPC水溶解)，顛倒數(shù)次混勻；7 500 r/min，4 ℃ 5 min，棄上清液，小心吸盡液體(此時(shí)可以看到白色沉淀即為RNA)；RNA略干后加入20 μL DEPC水。用核酸染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-296在卵巢癌中的表達(dá)研究。引物序列為：miR-296，F(xiàn)-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT；R-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG。U6，F(xiàn)-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG；R-CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT。

1.2.2miRNA分子雜交方法采用(Ambion公司)小分子分離試劑盒分理處小分子RNA，將提取完的小分子RNA進(jìn)行Cy3標(biāo)記，進(jìn)而與miRNA芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，miRNA芯片購(gòu)自于Affymetrix Human Geome公司。

1.2.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)的miR-296的卵巢癌細(xì)胞株

將處于對(duì)數(shù)期的SKOV3(購(gòu)自于ATCC)種于六孔板中，保證每孔細(xì)胞量為3×105～8×105，lipo2000加入5 μl用100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基混勻，靜置5 min，同時(shí)高表達(dá)的miR-296的質(zhì)粒12 μl于100 μl無(wú)血清的培養(yǎng)基中混勻，5 min后兩者混勻20 min，然后加入1 800 μl的無(wú)血清培養(yǎng)基，48 h后提取RNA進(jìn)行檢測(cè)。過表達(dá)miR-296序列合成于廣州銳博生物公司。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)分析，χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1標(biāo)本中RNA質(zhì)量檢測(cè)

在RNA檢測(cè)中會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)RNA降解，所以在進(jìn)行microRNA檢測(cè)前我們進(jìn)行RNA純度的檢測(cè)，其檢測(cè)方法是RNA凝膠電泳檢測(cè)，采取28 s和18 s的比例，28 s和18 s是真核生物rRNA(核糖體RNA)的2個(gè)主要亞基，在體內(nèi)含量較多。28 s/18 s即為衡量提取的RNA完整性的指標(biāo)，如果28 s/18 s為1.8～2.0表明所提取RNA完整性較好，基本無(wú)降解發(fā)生。電泳條帶上應(yīng)是28 s在上，18 s在下，且亮度為28 s是18 s的2倍。結(jié)果見圖1。

圖1　RNA凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2miR-296在卵巢癌中的表達(dá)

在22例卵巢癌患者和22例正常卵巢患者中檢測(cè)miR-296的表達(dá)，在提取RNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)后，用U6作為內(nèi)參，將2組miR-296的表達(dá)內(nèi)參化后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中miR-296高表達(dá)，與正常卵巢組織比較，表達(dá)存在明顯差異，P<0.001，見圖2。

圖2　miR-296在卵巢癌組織中的表達(dá)

2.3在卵巢癌中miR-296靶基因檢測(cè)

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)我們所提取的RNA純度較高，且未出現(xiàn)降解等情況。SKOV3是臨床上經(jīng)常用于科學(xué)研究的卵巢癌細(xì)胞株，在我們轉(zhuǎn)染高表達(dá)的miR-296后，檢測(cè)其下游的靶基因。在我們的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，microRNA143和microRNA215在miR-296轉(zhuǎn)染組中高表達(dá)，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p在轉(zhuǎn)染組中低表達(dá)。見圖3。

中間線表示理想回歸線，上下線表示理想預(yù)測(cè)的1個(gè)對(duì)數(shù)單位

3討論

卵巢癌是1種高度惡性的腫瘤，其發(fā)病機(jī)理也比較復(fù)雜?；虻谋磉_(dá)異常產(chǎn)生了腫瘤，MicroRNA在卵巢癌中的研究越來(lái)越多，也越來(lái)越深入，在卵巢癌初期miRNA的篩查中發(fā)現(xiàn)很多基因表達(dá)異常，許多已經(jīng)被廣大研究者公認(rèn)為抑癌基因，當(dāng)然也有很多基因被認(rèn)為是促癌基因。有越來(lái)越多的microRNA被用來(lái)作為腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用到臨床研究上[9]。miR-296早期被用來(lái)抗血管生成的研究，其主要是通過影響細(xì)胞極性進(jìn)而改變細(xì)胞運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，如影響極性蛋白scrib。有研究報(bào)道，當(dāng)miR-296過表達(dá)時(shí)會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)[10]。

但是關(guān)于miR-296的靶基因研究還未見過多報(bào)道，特別是在卵巢癌中的研究。有研究報(bào)道m(xù)iR-296可以調(diào)控VEGFR2和PDGFRβ信號(hào)通路進(jìn)而影響前列腺癌的腫瘤進(jìn)程，這一研究主要集中在通過miR-296的表達(dá)進(jìn)而影響血管的生成，達(dá)到影響腫瘤[11-12]。卵巢癌的致死率也逐漸引起廣大醫(yī)療科研工作者的重視，但是調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜，所以尋找一個(gè)好的基因靶點(diǎn)顯得尤為重要。

在前人的研究中已經(jīng)有學(xué)者報(bào)道m(xù)iR-296與腫瘤之間的關(guān)系，但是卵巢癌中的研究還未見報(bào)道。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)在 RNA純度等多方面均完好的情況下miR-296在卵巢癌中高表達(dá)，且存在明顯差異。當(dāng)我們轉(zhuǎn)染高表達(dá)的miR-296的卵巢癌細(xì)胞系時(shí)，發(fā)現(xiàn)microRNA143和microRNA215在轉(zhuǎn)染組中高表達(dá)，microRNA96、microRNA551b、microRNA502-3p低表達(dá)。這些基因的表達(dá)差異是我們研究的創(chuàng)新點(diǎn)，據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)觀察可得出，這些微小RNA有可能作為卵巢癌診斷分子標(biāo)記物。

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(編輯：甘艷)

Expression of miR-296 in Ovarian Cancer and Prediction of Its Target Gene Research

QUANXiaozhen,LANYanli.

XiangyangCentralHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang，441021

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of miR-296 expression in ovarian cancer and prediction of its target gene research.MethodsCollect our oncology patient samples 22 cases of ovarian cancer tissues,and 22 cases of normal tissues were collected.After testing the purity of RNA,we screen the expression of miR-296,in ovarian cancer were detected,and test the target gene were tested after transferred with high miR-296 by genechip technology.ResultsWe found that the miR-296 had high expression in ovarian cancer,and compared with the control had statistical significance normal,P<0.001.When transferred with high miR-296 in ovarian cancer cell lines(SKOV3),we found that that microRNA143 and microRNA215 were upregulated in the group with high expression miR-296,and microRNA96、microRNA551b and microRNA502-3p were down-regulated expression.ConclusionThe miR-296 are highly expressed in ovarian cancer,and the potential target gene may as ovarian cancer molecular marker in clinic.

【Key words】miR-296;Ovarian cancer;Target gene

通訊作者：蘭艷麗

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.009

中圖分類號(hào)：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)05-0727-03

(收稿日期2015-07-21修回日期 2015-12-10)