宋保志　劉佳華　高玉玲　孫　陽　陳　政　石　紅

350001 福建醫(yī)科大學省立臨床學院

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P16INK4A在宮頸上皮內瘤變中的表達及與HPV感染的關系

宋保志劉佳華高玉玲孫陽陳政石紅

350001 福建醫(yī)科大學省立臨床學院

【摘要】目的探討抑癌基因P16INK4A在宮頸上皮內瘤變中的表達情況及其與HPV感染的相關性。方法采用免疫組化染色法，對59例宮頸上皮瘤變(CIN)標本、30例病理檢查為正常宮頸組織的標本進行檢測。結果CIN Ⅰ級組織中ILK表達陽性率62.50%、CIN Ⅱ～Ⅲ級為65.71%，均顯著高于正常宮頸組織(23.33%)，且差異均具有統計學意義(χ2=8.472，P=0.004<0.05；χ2=11.675，P=0.001<0.05)；CIN Ⅰ級組織中ILK表達陽性率與CIN Ⅱ～Ⅲ級比較差異無統計學意義(χ2=0.064，P=0.800>0.05)。P16INK4A在HPV16、HPV18 2種高危型宮頸HPV感染中的表達顯著高于其他高危型或者低危型(HPV53、HPV58、HPV6)。結論P16INK4A在宮頸上皮內瘤變(CIN)中顯著高表達，同時P16INK4A高表達可能與HPV16、HPV18的陽性表達具有協同作用。

【關鍵詞】P16INK4A；宮頸上皮內瘤變；免疫組化；HPV

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:730～733)

宮頸癌近年來已嚴重威脅了女性的健康，有報道宮頸癌根治術術后五年生存率不足30%，而現階段有關宮頸癌的早期篩查以宮頸細胞學以及宮頸HPV病毒的篩查為主，鑒于不同檢測方式導致的HPV感染陰性而宮頸細胞學檢查出不典型性宮頸上皮內病變的患者逐漸增加，而宮頸細胞學檢測同樣存在主觀性的特點，不同的檢驗科醫(yī)生的判斷標準有所區(qū)別，故臨床上對于宮頸癌的早期輔助篩查需要其他指標進行輔助篩查[1-2]。而近年來P16INK4A作為抑癌基因，其編碼的蛋白能特異性地抑制CDK4的活性，阻止細胞由G1期進入S期，負性調節(jié)細胞周期[3]。而部分學者認為P16INK4A可能在宮頸上皮內瘤變(CIN)的發(fā)生發(fā)展中起到促進作用，本研究通過探討59例宮頸上皮瘤變(CIN)標本、30例病理檢查為正常宮頸組織中P16INK4A的表達來揭示其相應的臨床價值，具體研究如下。

1材料與方法

1.1對象

納入標準：①宮頸上皮瘤變組織標本為本院手術切除的經病理學明確診斷的標本；②正常宮頸組織標本為本院門診實施婦科檢查，取活組織經病理檢查正常的標本；③所有研究對象近期未接受激素類等藥物治療。

排除標準：①未進行明確的病理學診斷的患者；②近期應用抗病毒、激素類藥物治療的患者。

選取本院收集的59例宮頸上皮瘤變(CIN)標本、30例病理檢查為正常宮頸組織的標本作為研究對象。CIN組標本59例，其中CIN Ⅰ級24例、CIN Ⅱ級20例，CIN Ⅲ級15例，年齡30～70歲，平均年齡(49.24±10.67)歲；30例正常宮頸組織病例，年齡32～65歲，平均年齡(45.24±8.52)歲。兩組病例的平均年齡未見統計學差異，提示兩組具有較好的可比性(P>0.05)。

1.2標本采集

宮頸上皮內瘤變標本以及正常宮頸組織標本均為本院婦科有經驗的宮頸領域專家采集，采集過程較為一致，其中宮頸上皮內瘤變組織為我院婦科陰道鏡門診收治的CIN病變患者術中切除的部分宮頸病變組織，而正常宮頸組織為我院婦科門診超聲聚焦治療對于宮頸糜爛以及部分宮頸息肉患者術中切除的部分宮頸組織，所有患者均知曉本次研究并簽署相關知情同意書。標本采集后統一放置4 ℃冰箱保存。

1.3檢測方法

應用免疫組化技術，檢測P16INK4A在宮頸上皮內瘤變以及正常宮頸組織中的表達，操作過程采用標準的石蠟切片法，P16INK4A相關一抗以及二抗均為南京凱基生物科技有限公司生產，二抗孵育后相關熒光的檢測采用熒光顯微鏡觀察(荷蘭phenom飛納高分辨率熒光顯微鏡)。mRNA水平的檢測采用組織研磨的方式提取RNA，并采用takara公司的逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，采用takara公司的熒光定量PCR試劑盒定量擴增P16INK4A基因，組間對比采用△△CT值對比。

1.4免疫組化判定標準

免疫組織化學法的結果判定標準，P16INK4A陽性表達細胞表現為細胞質黃色、棕黃色著色，按照著色強度進行分級，共分為4級。0分：無色；淡黃色：1分；棕黃色：2分，褐色：3分；顯微鏡下染色陽性細胞計數：1%～25%：1分；26%～50%：2分；51%～75%：3分；>75%:4分；兩個得分項目相加為最終評分，(-)為總分<3分，陰性表達；(+)為3分，弱陽性表達；(++)為4分，中度陽性表達；(+++)為5分及以上，強陽性表達。

1.5統計學分析

2結果

2.1P16INK4A在正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變中mRNA水平的表達(圖1)

結果提示：P16INK4A在宮頸上皮內瘤變患者中的表達異常發(fā)生率高于正常宮頸組織，差別具有統計學意義(P<0.05)；隨著宮頸上皮內病變的發(fā)展，P16INK4A表達呈現遞增趨勢，但未見統計學差異(P>0.05)。

圖1　P16INK4A mRNA 在正常宮頸以及宮頸上皮內瘤變

2.2免疫組化檢測結果

CIN Ⅰ級標本患者中P16INK4A表達陽性率為62.50%、CIN Ⅱ～Ⅲ級標本患者中為65.71%，均顯著高于正常宮頸組織標本的23.33%，且差異均具有統計學意義(χ2=8.472，P=0.004<0.05；χ2=11.675，P=0.001<0.05)；CIN Ⅰ級標本患者的P16INK4A表達陽性率與CIN Ⅱ～Ⅲ級標本患者的陽性表達率之間差異不具有統計學意義(χ2=0.064，P=0.800>0.05)，見表1。

表1　不同類型組織標本中P16INK4A的表達情況/例

2.3P16INK4A在不同宮頸HPV亞型感染中的表達情況(圖2)

于陰道鏡檢查前3天(第1天)、陰道鏡檢查當日(第4天)以及陰道鏡檢查后1周(第11天)，分別采用活檢鉗取部分宮頸上皮組織，檢測P16INK4A mRNA的表達水平，結果提示在HPV16、HPV18宮頸病變組織中，P16INK4A表達水平顯著高于其他HPV高?；颊?P<0.05)，并顯著高于HPV低危宮頸組織中P16INK4A表達水平(P<0.05) 。

圖2　P16INK4A在不同宮頸HPV亞型感染中的表達情況

3討論

近年來雖然宮頸病毒學HPV以及宮頸細胞學的檢測已廣泛應用于育齡期女性常規(guī)宮頸篩查，但鑒于不斷有臨床工作者報道發(fā)現不同數量的HPV陰性但宮頸細胞學檢測陽性的病例，特別是近年來宮頸HPV病毒轉錄水平的檢測E6/E7的廣泛開展，對于宮頸病毒學檢測陰性而轉錄水平陽性病例的報道逐漸增多[4-5]，這給臨床工作者對于早期宮頸病變篩查以及正確宮頸病變分流帶來了困擾[6]。而P16INK4A近年內被發(fā)現在宮頸上皮內瘤變的患者中顯著升高，提示P16INK4A可能參與到宮頸CIN病變的發(fā)生發(fā)展或者宮頸HPV感染的過程中[3,7]。

P16INK4A作為1種抑癌基因，其翻譯的蛋白主要通過特異性抑制CDK4蛋白以及CDK6蛋白的活性來調控細胞周期，使得細胞能顯著減緩由G1期進入S期的速率，干擾并抑制細胞過度增值[7]。如Genovés 等[8]學者發(fā)現在肺小細胞癌患者中，P16INK4A的表達顯著高于其他肺部惡性腫瘤亞型如腺癌，同時Genovés J,等認為，肺部小細胞癌中PI3K/AKT/HES信號通路的激活通過交錯作用捕獲部分轉錄水平調控因子如miRNA133來異常激活P16INK4A，并在蛋白水平進行了驗證；Carozzi 等[9]學者也發(fā)現，在FIGO臨床分期Ⅲ期患者中，P16INK4A在卵巢癌中的表達顯著高于FIGOⅠ期以及FIGO Ⅱ期的患者，并發(fā)現隨著淋巴轉移的進行以及腹腔內腹膜等遠處病灶的轉移，P16INK4A水平呈現一定的遞增趨勢，但未發(fā)現統計學意義。本研究發(fā)現，在CINⅡ～Ⅲ患者中，P16INK4A的轉錄水平的表達顯著高于正常宮頸組織，提示P16INK4A基因在宮頸上皮內病變的患者中異常擴增，這與之前的研究基本相符，考慮到宮頸HPV感染導致的CD4+CD8+Treg淋巴細胞的增值可能通過非編碼RNA的調控異常激活P16INK4A基因上游啟動子區(qū)域的增強結合部位，導致P16INK4A基因的異常擴增[9]，其結果為P16INK4A與T淋巴細胞共同參與到機體的抗腫瘤免疫反應中；另一方面，本研究發(fā)現，在CINⅡ～Ⅲ級以及CINⅠ級宮頸病變患者中，P16INK4A的蛋白水平表達顯著高于正常宮頸組織，這與之前轉錄水平的結論一致，但CINⅡ～Ⅲ級以及CINⅠ級宮頸病變患者亞組分析并未發(fā)現統計學差異，考慮到P16INK4A基因的異常激活呈現出的連貫性可能并不依賴于CD4+CD8+Treg淋巴細胞的持續(xù)高水平表達[10-11]，同時Solano 等[10]學者也認為，抗原提呈物質APC的高水平表達可能是P16INK4A蛋白下游PI3K/AKT/HES信號通路活化維持的主要關鍵因子，Solano 等發(fā)現在APC持續(xù)性低表達后，P16INK4A基因的擴增在一周內逐漸衰減。這些都提示P16INK4A基因在宮頸HPV感染導致的宮頸CIN病變患者中參與到了抗腫瘤免疫體系中，而其高水平的表達可能提示著HPV的活動性以及宮頸病變的持續(xù)進展。

高危型HPV16、HPV18是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要因素，臨床上對于HPV16、HPV18陽性的宮頸CIN患者考慮到預后往往較差，普遍采用陰道鏡活檢術確定組織學病理檢查結果，而跨過宮頸細胞學或者E6/E7的檢查，對于其他宮頸HPV高危陽性感染或者低危型感染，臨床上普遍采用規(guī)范的宮頸篩查分流體系進行常規(guī)分流治療。本研究在探討了P16INK4A與宮頸HPV感染的關系后發(fā)現，在宮頸高危型HPV16、HPV18感染患者中，P16INK4A的表達顯著高于其他宮頸高危型HPV或者低危型HPV感染，提示了P16INK4A對于作為篩查宮頸病變的重要潛在輔助價值。 目前具體機制尚無闡述，Ding 等[12]學者考慮到P16INK4A可能異常結合HPV16、HPV18翻譯蛋白的β亞基而促進了抗原提呈物質APC的抗原提呈作用，并協助其逃脫了CD4+CD8+Treg淋巴細胞的捕獲殺傷作用，但尚無重復性實驗的證實。

由此可見，P16INK4A在宮頸CIN病變中異常顯著表達，并且在HPV16、HPV18陽性的宮頸組織中異常高于其他宮頸HPV感染病例，這些都提示了P16INK4A可能在宮頸病變早期篩查中具有潛在輔助診斷價值。

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(編輯：吳小紅)

P16INK4A Expression in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Its Relationship with HPV

SONGBaozhi,LIUJiahua,GAOYuling,etal.

FujianMedicalUniversity,FujianProvincialClinicalHospital,Fuzhou,350001

【Abstract】ObjectiveTo investigate P16INK4A expression in the cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and its relationship with HPV.MethodsImmunohistochemical method used to detect 59 cases of cervical epithelial tumors and 30 cases of normal cervical tissues confirmed by pathological examination.ResultsThe positive expression rates of ILK in CIN Ⅰ samples and CIN Ⅱ～Ⅲ samples were 62.50% and 65.71%,which were significantly higher than that of normal cervical tissues(23.33%),and the difference was statistically significant(χ2=8.472,P=0.004<0.05),[(χ2=11.675,P=0.001<0.05)];The positive expression rates of ILK in CIN Ⅰ samples and CIN Ⅱ～Ⅲ samples had no statistically significant difference(χ2=0.064,P=0.800>0.05).The expression rates of P16INK4A in intraepithelial neoplasia tissues with HPV18 or HPV16 were significantly higher than the other high risk HPV types or low risk HPV types(HPV53、HPV58、HPV6).ConclusionThe expression of P16INK4A is significantly higher in CIN,and the expression of P16INK4A may have synergetic effect with HPV18 or HPV16.

【Key words】P16INK4A;Cervical intraepithelial neoplasia(CIN);Immunohistochemical technology;HPV

通訊作者：劉佳華

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.010

中圖分類號：R737.33

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)05-0730-04

(收稿日期2015-06-29修回日期 2016-03-10)