陳國慶， 王興新， 訾　聃*

(1.貴州醫(yī)科大學附院 婦產科, 貴州 貴陽　550004； 2.威寧縣人民醫(yī)院 婦產科, 貴州 威寧　553100)

?

Cyclin D1和Ki-67在卵巢上皮性癌中的表達及相關性*

陳國慶1**， 王興新2， 訾聃1***

(1.貴州醫(yī)科大學附院 婦產科, 貴州 貴陽550004； 2.威寧縣人民醫(yī)院 婦產科, 貴州 威寧553100)

[摘要]目的： 探討細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和增殖細胞核抗原(Ki-67)在卵巢上皮性癌中的表達及其與臨床病理間的關系。方法： 應用EnVision免疫組化法對40例卵巢上皮性癌(觀察組)及10例卵巢良性腫瘤組織(對照組)進行Cyclin D1和Ki-67表達水平檢測,比較Cyclin D1、Ki-67蛋白與卵巢癌的各項臨床病理指標的關系及兩種蛋白間的關系。結果： 觀察組Cyclin D1陽性表達率和Ki-67過表達率高于對照組,觀察組Cyclin D1陽性表達率在FIGO分期和組織學分級病理參數下比較,差異有統計學意義(P<0.05)，在年齡、組織學類型和淋巴轉移等病理參數下比較,差異無統計學意義(P>0.05)；Ki-67過表達率在FIGO分期方面比較,差異有統計學意義(P<0.05)；Cyclin D1陽性表達率和Ki-67過表達率呈現正相關性(r=0.370，P<0.05)。結論： Cyclin D1和Ki-67在卵巢上皮性癌中的共同表達可能是促進卵巢上皮性癌形成和發(fā)展的因素。

[關鍵詞]卵巢腫瘤； 細胞周期蛋白D1； 增殖細胞核抗原； 細胞周期； 免疫組織化學

卵巢癌是婦科臨床上常見惡性腫瘤類型，其發(fā)病率稍低于子宮頸癌和子宮內膜癌，但其惡性程度極高，死亡率在婦科生殖系統惡性腫瘤中位居首位。卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)在卵巢癌中所占比例為85%～90%，好發(fā)年齡50～60歲，早期常無明顯癥狀。由于卵巢位居盆腔深部，早期癥狀不明顯，所以不易早期發(fā)現，因此常錯過手術治療最佳時機[1]。臨床常規(guī)的腫瘤標志物特異度和敏感度均不高，因此也影響卵巢癌的預后，降低遠期生存率。故而積極探尋全新的較為理想的腫瘤標志物對臨床診斷和治療均具有至關重要的作用。細胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1,Cyclin D1)和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，Ki-67)在EOC組織細胞增殖和凋亡過程中具有重要調控作用，可引起細胞異常增殖，最終導致惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展[2]。但是目前關于兩種生物標志物在卵巢上皮性癌不同臨床病理參數條件下的表達情況研究甚少?；诖?，本研究通過檢測Cyclin D1和Ki-67在EOC中及不同臨床病理參數條件下的表達情況，確定二者表達的相關性，探討兩者在卵巢癌形成及發(fā)展中所起的作用。

1對象與方法

1.1臨床資料

收集2011年1月～2015年12月40例EOC患者手術蠟塊標本(觀察組)，另選取同期手術的卵巢良性腺瘤10例(對照組)。所有患者臨床資料完整，手術標本均送至病理科經檢查證實且術前未接受過放、化療及免疫治療。觀察組年齡16～83歲，平均(49.37±10.25)歲。觀察組組織學類型，黏液性腺癌7例，漿液性腺癌33例；組織學分級，低分化12例，中分化24例，高分化4例；FIGO(2009年)分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期6例，Ⅲ期18例，Ⅳ期2例，7例有淋巴結轉移；對照組年齡17～69歲，平均(48.92±10.31)歲，組織學類型有漿液性囊腺瘤3例，黏液性囊腺瘤7例。

1.2方法

Cyclin D1兔抗人單克隆抗體、Ki-67鼠抗人單克隆抗體及EnVision試劑盒(均購自福州邁新生物技術有限公司)；采用EnVision免疫組化法進行，將選好的蠟塊，3 μm連續(xù)切片，每例切4張，取其中1張做蘇木素-伊紅(HE)染色，其余做免疫組化染色。一抗工作濃度根據預實驗結果調整，Ki-67、Cyclin Dl均為1∶100。免疫組化染色程序嚴格按照試劑盒說明方法染色，所有切片染色均在相同條件下進行，每批染色均設陽性對照(試劑公司提供)和陰性對照(PBS代替一抗)。

1.3觀察指標

Ki-67和Cyclin Dl于細胞核內出現黃色或棕黃色反應物顆粒為陽性細胞。陰性對照用PBS液分別代替一抗Cyclin D1、Ki-67；陽性對照，Cyclin D1、Ki-67采用乳腺癌切片作陽性對照。具體評分標準參照Fromowitz的綜合計分法進行，首先是染色強度評分：無染色為0分；呈現淡黃色顆粒，明顯高于背景為1分；呈現淺棕黃色顆粒為2分；出現大量深棕黃色顆粒為3分。根據陽性細胞數進行評分：每片隨機觀察5個視野，計數500個細胞中染色陽性細胞數，陽性細胞數<5%為0分；陽性細胞數5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。染色強度評分與陽性細胞數比例的評分相加之和<2為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。弱陽、中陽、強陽均判為陽性，以中度陽性和強陽性為過表達。

1.4統計學方法

應用SPSS 16.0統計軟件包統計，兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗，不滿足χ2檢驗條件時采用連續(xù)校正公式或FISH精確概率檢驗法。相關性采用Spearman秩相關系數分析，以ɑ=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組卵巢腫瘤組織Cyclin D1和Ki-67表達

觀察組Cyclin D1陽性表達率和Ki-67過表達率較對照組顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1及表1。

注：A、B為Cyclin D1，C、D為Ki-67；A、C為實驗組中的強陽性表達，B、D為對照組中陰性表達和弱表達圖1　兩組卵巢腫瘤中Cyclin D1和Ki-67表達(EnVision,×20)Fig.1　Expression of Cyclin D1 and Ki-67 in ovarian tumor by immunohistochemistry method

組別nCyclinD1-++++++陽性率Ki-67-++++++過表達率觀察組40141411126(65.00)47101929(72.50)對照組1082002(20.00)71202(20.00)χ24.8757.263P0.0270.007

2.2Cyclin D1、Ki-67表達與臨床病理學

觀察組Cyclin D1陽性表達率在年齡、淋巴結轉移及組織學類型方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而在FIGO分期、組織學分級病理學參數條件下差異具有統計學意義(P<0.05)；Ki-67過表達率在年齡、淋巴結轉移、組織學分級和組織學類型方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而在FIGO分期方面比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2和表3。

表2　Cyclin D1表達與臨床病理學(n，%)

表3　Ki-67表達與臨床病理學(n，%)

2.3觀察組Cyclin D1和Ki-67表達相關性

觀察組中Cyclin D1的表達與Ki-67的過表達之間呈現正相關(r=0.370，P<0.05)，見表4。

表4　觀察組卵巢上皮性癌組織中Cyclin D1

3討論

EOC是女性常見的惡性腫瘤，其病因和發(fā)病機制至今尚未完全闡明[3]。目前普遍認為細胞增殖失控和轉移是卵巢癌發(fā)生發(fā)展的基礎。細胞增殖受正向和負向兩種調節(jié)因素的影響，生理狀態(tài)下兩者處于平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，將導致疾病的發(fā)生。如果正向因素過表達，細胞無限增殖，最終導致癌癥[4]。Cyclin D1是細胞周期素家族中主要成員之一，可正向調控細胞周期。在正常細胞周期中，Cyclin D1只表達于G1期，在視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)形成過程中作用顯著，之后細胞增殖會迅速進入S期，而 Cyclin D1蛋白將會在短時間內降解[5-6]。在包括EOC在內的惡性腫瘤組織中，Cyclin D1基因被激活并異常高表達，使得細胞G1期向S期轉化被異?？s短，從而打破細胞增殖和凋亡平衡，促進細胞增殖和腫瘤生成。Ki-67是目前受醫(yī)學工作者普遍關注的另一項腫瘤標志物，Ki-67蛋白表達程度在細胞周期的各個階段都不同，在G1中期到后期開始表達，S期和G2期表達逐漸增加，M期達到高峰，當有絲分裂結束后，迅速降解，半衰期僅為1 h或更短，被認為是一種增殖細胞核抗原[7]。Ki-67在不同腫瘤組織中幾乎均有表達，因而在臨床中廣泛應用以判斷細胞周期活性，鑒別良惡性腫瘤。cyclinD1和Ki-67同時表達已經在各種各樣的腫瘤中發(fā)現；據有關研究資料報道，在EOC患者中，Cyclin D1和Ki-67陽性表達率均遠遠高于卵巢良性腺瘤，且在FIGO分期、淋巴結轉移、組織學分級等不同病理參數條件下表達情況均具有顯著差異，其中Ⅲ、Ⅳ期、低分化中陽性表達率更高，而與病理類型無關;提示Cyclin D1和Ki-67對卵巢腫瘤良惡性的鑒別及對卵巢上皮性癌診斷、預后評價具有重要的參考價值，可用以判斷病情，參與輔助治療。

本研究結果顯示，觀察組Cyclin D1陽性表達率和Ki-67過表達率顯著高于對照組，提示兩者促進了卵巢腫瘤惡變的過程。進一步分析兩者在EOC中的表達與臨床病理特征發(fā)現，Cyclin D1陽性率在FIGO分期、組織學分級方面存在顯著差異，而與年齡、病理類型和有無淋巴轉移無關；Ki-67在FIGO分期方面具有顯著差異，與病理類型，有無淋巴轉移及組織分級無關；提示兩者均能促進卵巢惡性腫瘤的增殖、浸潤。本研究結果顯示兩者在EOC中的表達與淋巴轉移無關，與姚俊閣、呂藝等[8-9]研究結果不符，可能與樣本量少或判斷標準不同有關，需擴大樣本量及統一判斷標準進一步研究。本研究還發(fā)現EOC中Cyclin D1陽性表達率和Ki-67過表達率呈正相關，可能機制為Ki-67過表達促進Cyclin D1正向調控細胞周期，促進腫瘤增殖，發(fā)展。

綜上，Cyclin D1和Ki-67可以參與輔助診斷EOC，隨著Cyclin D1陽性表達率升高，Ki-67過表達率也明顯升高，二者呈現正相關性共同促進腫瘤生成和進展，Cyclin D1和Ki-67同時異常高表達可打破細胞增殖和凋亡平衡，可能是卵巢上皮性癌發(fā)生和進展病理基礎，兩者在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起協同作用，可輔助臨床診斷和為臨床治療提供靶點。

4參考文獻

[1] 舒敏，訾聃，楊英捷.CXCR4及EMT相關因子在卵巢癌中的表達及臨床意義[J].中國婦幼保健， 2015 (13):2074-2076.

[2] Li W,Cai JH,Zhang J ,et al.Effects of cyclooxygenase inhibitors in combination with taxol on expression of cyclin d1 and ki-67 in a xenograft model of ovarian carcinoma[J].Int J Mol Sci, 2012(14):1715-1724.

[3] 任婕，彭芝蘭.細胞周期蛋白依賴性激酶2在上皮性卵巢癌中的表達及意義[J].貴陽醫(yī)學院學報， 2014(2):167-169.

[4] 任斐,姜文靖,王虎生,等.Cyclin D1 、Ki67在大腸癌組織中的表達及預后意義分析[J].世界中西醫(yī)結合雜志, 2015(7):959-961.

[5] 邵琳，原銀萍，田永杰.凝溶膠蛋白、細胞周期蛋白1在卵巢上皮性腫瘤中的表達及其意義[J].實用婦產科雜志， 2011(5):346-349.

[6] 唐云炳,顏林志,劉奕,等.上皮性卵巢癌中Cyclin D1和p27的表達及其臨床意義[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2010(4):35-37.

[7] Peng Y,Wang L,Gu J.Elevated preoperative carcinoembryonic antigen(CEA)and Ki67 is predictor of decreased survival inⅡA stage colon cancer[J].World J Surg, 2013(1):208-213.

[8] 姚俊閣,李紅雨，趙書君，等.卵巢上皮性癌組織中 SOX2和CyclinD1的表達[J].鄭州大學學報, 2014(2):247-250.

[9] 呂藝，劉恩玉，賈桂英，等.Survivin、Ki-67與CD105在上皮性卵巢癌的表達及臨床意義[J].黑龍江醫(yī)學， 2011(6):401-404.

(2016-01-01收稿，2016-04-10修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

Expression of Cyclin D1 and Ki-67 in Epithelial Ovarian Cancer and Expression Correlation

CHEN Guoqing1, WANG Xingxing2, ZI Dan1

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,WeiningCountyPeople'sHospital,Weining553100,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the expression of Cyclin D1 and Ki-67 in epithelial ovarian cancer and the correlation between their expression and clinical pathology. Methods: EnVision immunohistochemical assay kit was adopted to detect the expression level of Cyclin D1 and Ki-67 protein in 40 cases of patients with epithelial ovarian cancer (observation group) and 10 cases of patients with benign ovarian tumors (control group). The relationship between Cyclin D1 protein expression level and Ki-67 protein expression level was also observed and compared.Results: The positive expression rate of Cyclin D1 and the over-expression rate of Ki-67 in observation group were higher than those in control group. There were statistical differences in positive expression rates of Cyclin D1 between observation group and control group when compared in terms of pathological parameters such as FIGO clinical staging and histological grading(P<0.05), but there were no statistical differences between observation group and control group when compared in terms of pathological parameters such as age, histological type and lymph node metastasisin (P>0.05). There were statistical differences in over-expression rates of Ki-67 between observation group and control group when compared in terms of FIGO clinical staging(P<0.05). The data showed that the positive expression rate of Cyclin D1 and the over-expression rate of Ki-67 was positively correlated (r=0.370, P<0.05). Conclusion: Co-expression of Cyclin D1 and Ki-67 in epithelial ovarian cancer may be the factors that promote the pathogenesis and progression of epithelial ovarian cancer.

[Key words]ovarian tumor; Cyclin D1; proliferating cell nuclear antigen; cell cycle; immunohistochemistry

*[基金項目]貴州省科技廳聯合基金[黔科合LG 字(2011) 032 號]

[中圖分類號]R737.31

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0539-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.011

**貴州醫(yī)科大學2015級同等學歷碩士研究生，現工作于威寧縣人民醫(yī)院

***通信作者 E-mail:2816497455@qq.com

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2057.026.html