蔣　智， 潘裕佳,2， 賈中申,2， 吳玥婷， 李安潔， 韋　方,2**

(1.貴州省人民醫(yī)院 心內(nèi)科， 貴州 貴陽　550002； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽　550025)

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EdCC保護(hù)乳小鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激所致細(xì)胞損傷及凋亡*

蔣智1， 潘裕佳1,2， 賈中申1,2， 吳玥婷1， 李安潔1， 韋方1,2**

(1.貴州省人民醫(yī)院 心內(nèi)科， 貴州 貴陽550002； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽550025)

[摘要]目的： 觀察子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(EnSCs)來源細(xì)胞因子“雞尾酒”(EdCC)對乳小鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡的保護(hù)作用。方法： 乳小鼠心肌細(xì)胞分為正常組、對照組和EdCC組，用過氧化氫(H2O2)造成氧化應(yīng)激，檢測上清液乳酸脫氫酶(LDH)活性，TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡，DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧族(ROS)濃度。結(jié)果： EnSCs呈成纖維細(xì)胞樣貼壁生長，EdCC蛋白提取效率為每24 h提取 (241.3±32.1)μg/106個(gè)細(xì)胞；與對照組比較，EdCC組(100 mg/L)上清液LDH活性明顯降低，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，細(xì)胞內(nèi)ROS濃度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論： EdCC減輕體外培養(yǎng)乳小鼠心肌細(xì)胞氧化損傷及凋亡，可能與降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]子宮內(nèi)膜； 干細(xì)胞； 細(xì)胞因子； 心肌細(xì)胞； 活性氧； 凋亡

急性心肌梗死已成為我國最主要的致死原因[1]。早期再灌注治療能明顯縮小梗死面積改善患者預(yù)后，但再灌注是一把雙刃劍，再灌注損傷引起缺血心肌的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步加重削弱了再灌注治療的獲益[2]。其中，活性氧族(reactive oxygen species，ROS)引起的細(xì)胞損傷和凋亡是再灌注損傷的重要機(jī)制[3]。隨著介入治療的發(fā)展，如何防治再灌注損傷保護(hù)缺血心肌已成為急性心肌梗死治療中亟待解決的問題[4]。干細(xì)胞通過分泌多種細(xì)胞因子保護(hù)心肌損傷并促進(jìn)心肌修復(fù)，即旁分泌效應(yīng)[5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrial stem cells, EnSCs)通過旁分泌效應(yīng)減少大鼠心肌梗死面積，保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心梗后心功能[6]。本研究從EnSCs培養(yǎng)液中提取細(xì)胞因子“雞尾酒”(EnSCs derived Cytokine Cocktail, EdCC)，推測EdCC具有心肌保護(hù)作用，觀察EdCC對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)液、高糖DMEM培養(yǎng)液、含EDTA胰蛋白酶、PBS(HyClone，中國)，Ⅱ型膠原酶(Worthington，美國)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning，美國)，Millipore超濾離心管(Millipore，美國)，3% H2O2溶液、多聚甲醛(凱信，中國)，TUNEL試劑盒、DCFH-DA試劑盒(Invitrogen，美國)，兔抗小鼠Troponin I、DyLight 550驢抗兔IgG(Abcam，美國)。新生1～3 d昆明小鼠，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2EnSCs培養(yǎng)

人EnSCs細(xì)胞株購自易文賽生物技術(shù)有限公司(杭州，中國)。液氮凍存的細(xì)胞株用37 ℃水浴快速溶解后用含10%胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液洗去凍存液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液，以后每3 d換液，生長融合達(dá)70%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3EdCC制備與儲存

將EnSCs按每25 cm2面積下8×105個(gè)細(xì)胞種入培養(yǎng)瓶，24 h后用PBS反復(fù)洗去含血清培養(yǎng)基，加入每25 cm2面積下加入3 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后吸出無血清培養(yǎng)液，5 000 r/min離心15 min，棄沉淀取上清，用Millipore超濾離心管截留上清液中分子量>10 kd的蛋白，蛋白定量后-80 ℃冰箱儲存。Millipore超濾技術(shù)可將EnSCs上清液蛋白濃縮70～80倍。

1.4心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)及分組

將乳小鼠心室肌剪碎，反復(fù)加消化液(含0.125% EDTA胰酶和0.1% Ⅱ型膠原酶)于37 ℃消化，吸出上層混濁液置于培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的高糖DMEM)終止消化，直至消化完全。最后細(xì)胞懸液1 000 r/min離心10 min，棄上清，底層細(xì)胞加培養(yǎng)液種入培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱靜止1.5 h，吸出未貼壁細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，用含100 μmol/L BRDU的培養(yǎng)液重懸，按2.5×105細(xì)胞/孔種入24孔板，放入培養(yǎng)箱，24 h后換液，72 h后用于實(shí)驗(yàn)。正常組和對照組加無血清DMEM/F12，EdCC組加不同劑量EdCC，30 min后對照組和EdCC組加1 mmol/L H2O2進(jìn)行氧化應(yīng)激損傷，6 h后收集培養(yǎng)液檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性，細(xì)胞用TUNEL染色檢測凋亡，用DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量[6]。EnSCs的鑒定見文獻(xiàn)[6]。

1.5LDH活性檢測

培養(yǎng)液5 000 r/min離心10 min，取上清用奧林巴斯5400全數(shù)字全自動(dòng)生化儀檢測各組心肌細(xì)胞上清液LDH活性。

1.6心肌細(xì)胞凋亡率

TUNEL染色和Troponin I熒光染色檢測心肌細(xì)胞凋亡率。乳小鼠心肌細(xì)胞用4%多聚甲醛溶液固定5 min，0.2% TritonX100穿膜5 min，PBS-T洗3次，5% BSA封閉30 min，加兔抗小鼠Troponin I 4 ℃孵育過夜，PBS-T洗3次，加DyLight 550驢抗兔IgG于室溫孵育2 h，PBS-T洗3次，加預(yù)混的TUNEL染液在37 ℃下孵育60 min，PBS洗3次，加1 mg/L Hoechst孵育5 min，PBS洗3次，用倒置熒光顯微鏡觀察，每孔取5個(gè)隨機(jī)高倍鏡視野拍照，用Image Pro軟件計(jì)數(shù)Troponin I陽性TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占Troponin I陽性細(xì)胞的比例。

1.7ROS檢測

乳小鼠心肌細(xì)胞用PBS洗3次，用含5 μmol/L DCFH-DA培養(yǎng)液于37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，用倒置熒光顯微鏡觀察，固定曝光時(shí)間、光柵等所有參數(shù)，每孔取5個(gè)隨機(jī)高倍鏡視野拍照，用Image Pro軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1EnSCs生長形態(tài)及EdCC提取效率

EnSCs貼壁生長，大部分為紡錘形，細(xì)胞核圓形位于細(xì)胞中間(圖1)。EdCC提取效率為每24 h提取(241.3±32.1)μg/106個(gè)細(xì)胞。

圖1　體外培養(yǎng)EnSCs生長(200×)Fig.1　Morphology of cultured EnSCs in vitro

2.2心肌細(xì)胞上清液LDH活性

與正常組比較，H2O2處理6 h后對照組上清液LDH活性明顯升高，與對照組比較，EdCC濃度達(dá)50 mg/L時(shí)上清液LDH活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EdCC濃度達(dá)100 mg/L時(shí)LDH活性最低，見圖2。

(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與EdCC 50 mg/L組比較，P<0.05圖2　各組心肌細(xì)胞上清液中LDH活性Fig.2　LDH activity in the supernatants of cardiomyocytes

2.3心肌細(xì)胞凋亡率

EdCC組(100 mg/L)心肌細(xì)胞凋亡率較對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

注：A為心肌細(xì)胞TUNEL染色及Troponin I熒光染色(400×)，B為定量分析心肌細(xì)胞凋亡率(n=6)；(1)與對照組比較，P<0.01圖3　心肌細(xì)胞凋亡Fig.3　EdCC group and control group cardiomyocytes apoptotic ratio

2.4心肌細(xì)胞ROS

EdCC組(100 mg/L)熒光強(qiáng)度明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示EdCC降低細(xì)胞內(nèi)ROS，見圖4。

注：A為心肌細(xì)胞用DCFH-DA負(fù)載后的熒光照片(400×),B為定量分析熒光強(qiáng)度(n=6)；(1)與對照組比較，P<0.01圖4　心肌細(xì)胞ROSFig.4　Cardiomyocytes ROS of EdCC group and control group

3討論

EnSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，可從月經(jīng)血中分離培養(yǎng)，具有無創(chuàng)獲取、增殖速度快、傳代穩(wěn)定、低免疫原性及無倫理道德問題等優(yōu)勢，是異體移植“現(xiàn)貨”干細(xì)胞產(chǎn)品中極具潛力的種子細(xì)胞[7-8]。但直接移植EnSCs有致心律失常、腫瘤形成、血栓栓塞等潛在風(fēng)險(xiǎn)，阻礙了EnSCs的研究和臨床應(yīng)用[9-11]。本研究首次從EnSCs培養(yǎng)液中提取EdCC，并研究其心肌保護(hù)作用，通過體外實(shí)驗(yàn)證明了EdCC能減輕H2O2所致的心肌細(xì)胞損傷和凋亡，并降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

細(xì)胞內(nèi)絕大部分ROS由線粒體生成，通常僅有少量ROS流出線粒體外，抗氧化系統(tǒng)能及時(shí)清除ROS，缺血再灌注損傷時(shí)線粒體mPTP通道異常開放，導(dǎo)致大量ROS泄漏造成細(xì)胞不可逆損傷是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的重要原因[3]。本研究利用H2O2模擬缺血再灌注的氧化應(yīng)激損傷，H2O21 mmol/L作用6 h可較穩(wěn)定的損傷乳小鼠心肌細(xì)胞并誘導(dǎo)凋亡[12]。心肌細(xì)胞膜損傷后通透性增加，LDH泄漏至細(xì)胞外，因此培養(yǎng)液中LDH活性水平與細(xì)胞膜損傷程度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)100 mg/L EdCC能最大程度降低培養(yǎng)液中LDH活性，提示EdCC 100 mg/L是體外實(shí)驗(yàn)保護(hù)心肌細(xì)胞的最佳濃度。缺血再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞死亡中凋亡約占80%[13]。為明確EdCC對心肌細(xì)胞凋亡的作用，本研究聯(lián)合Troponin I免疫熒光染色和TUNEL染色排除混雜的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的影響[6]；本研究結(jié)果可靠的證明了EdCC可降低約50%的心肌細(xì)胞凋亡。DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后可被ROS氧化形成有熒光的DCF，因此DCF的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平正相關(guān)。本研究檢測的細(xì)胞內(nèi)ROS包括外源進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的H2O2和內(nèi)源線粒體漏出的ROS，EdCC能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，這提示EdCC可能保護(hù)線粒體功能阻斷mPTP開放，也可能提高抗氧化系統(tǒng)清除ROS能力。EnSCs移植可激活心肌ERK1/2、STAT3和AKT促存活信號通路[14]，推測EdCC的心肌細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)也是通過上述機(jī)制產(chǎn)生，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，EdCC減輕體外培養(yǎng)乳小鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡，可能與降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平有關(guān)，該結(jié)果為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究EdCC對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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(2016-01-15收稿，2016-04-30修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙毅

EdCC Protective Effect on Neonatal Cardiomyocytes from Oxidative Stress Induced Injury and Apoptosis

JIANG Zhi1, PAN Yujia1,2, JIA Zhongshen1,2, WU Yueting1, LI Anjie1, WEI Fang1,2

(1.CardiologyDepartment,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China;2.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protective effect of endometrial stem cells (EnSCs) derived from cytokine cocktail (EdCC) on neonatal mouse cardiomyocytes under oxidative stress induced injury and apoptosis. Methods: Neonatal mouse cardiomyocytes were divided into normal group, control group and EdCC group. H2O2 was used to induce oxidative stress. The lactate dehydrogenase (LDH) activity in supernatants was determined to evaluate cell damage, TUNEL staining was used to count apoptotic cells and DCFH-DA was used to measure intracellular reactive oxygen species (ROS) concentration. Results: EnSCs were adherent fibroblast-like cells and the efficiency of EdCC concentration was(241.3±32.1)g/106 cells in every 24 h. As compared with control group, the LDH activity in supernatants greatly reduced in EdCC group (EdCC 100 g/mL) (P<0.01), and also the apoptotic cardiomyocyte ratio (P<0.01) and intracellular ROS concentration (P<0.01), difference was statistical significant. Conclusion: EdCC alleviated oxidative stress induced injury and cell apoptosis in neonatal mouse cardiomyocytes, possibly associated with decreasing intracellular ROS level.

[Key words]endometrium; stem cells; cytokine; cardiomyocytes; reactive oxygen species; apoptosis

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460050)； 貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金[黔科合J字(2014)2112號]； 貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金(gzwkj2013-1-006)

[中圖分類號]R54

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0520-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.006

**通信作者 E-mail:weifanggzsy@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2156.056.html