趙英華，劉曉昌，高　樂，陳李彤，楊子檜，王　磊

710004 陜西，西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科(趙英華)； 710032 陜西 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科(劉曉昌，高樂，陳李彤，楊子檜，王磊)

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·短篇論著·

神經(jīng)生長因子修飾的間充質(zhì)干細胞促進兔下頜骨牽張成骨時下牙槽神經(jīng)損傷修復(fù)的實驗研究

趙英華，劉曉昌，高樂，陳李彤，楊子檜，王磊

710004 陜西，西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科(趙英華)； 710032 陜西 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科(劉曉昌，高樂，陳李彤，楊子檜，王磊)

【摘要】目的探討慢病毒介導(dǎo)的人神經(jīng)生長因子β(hNGFβ)在兔下頜骨牽張成骨模型中促進下牙槽神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。方法分離兔下頜骨中的骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)并通過重組的慢病毒將hNGFβ基因插入到其基因序列中。對20只新西蘭白兔進行下頜骨牽張成骨，并在手術(shù)時向骨牽張縫隙下牙槽神經(jīng)周圍植入經(jīng)hNGFβ基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC或?qū)φ誐SC(每組10只)。經(jīng)過牽張，在固定期第14天處死動物并獲取下牙槽神經(jīng)樣本進行神經(jīng)組織學(xué)分析和神經(jīng)組織形態(tài)定量分析。結(jié)果下牙槽神經(jīng)組織分析顯示，移植hNGFβ基因修飾MSC組與對照組相比較，有更多的再生神經(jīng)纖維和更少的神經(jīng)變性。神經(jīng)組織形態(tài)定量分析顯示，與對照組相比，移植hNGFβ基因修飾MSC組的有髓纖維密度顯著增多，提示移植hNGFβ基因修飾MSC能夠顯著地加快兔下頜骨牽張成骨過程中的下牙槽神經(jīng)的修復(fù)。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)hNGFβ基因修飾MSC將有希望為臨床減少牽張成骨造成的下牙槽神經(jīng)損傷提供一種有效的基因治療方法。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)損傷； 神經(jīng)生長因子； 基因； 下頜骨； 牙槽； 兔

牽張成骨通過切開骨骼，逐漸在切骨線兩端牽張骨間隙，促進新骨形成，同時使骨骼周圍的肌肉、神經(jīng)、血管、皮膚同期延長，從而達到延長骨骼的目的[1]，現(xiàn)在已普遍應(yīng)用于臨床治療上下頜骨各種類型的發(fā)育不全畸形和骨缺損畸形[2]。然而，臨床觀察常有患者因下牙槽神經(jīng)損傷導(dǎo)致感覺異常[3-4]。牽張成骨術(shù)中的下牙槽神經(jīng)損傷原因包括外科手術(shù)的直接損傷和牽張力增加導(dǎo)致的間接損傷。大部分對下牙槽神經(jīng)的直接損傷可以通過謹慎的外科手術(shù)規(guī)劃和精細的手術(shù)技術(shù)避免，但是下牙槽神經(jīng)在人為牽引力下的損傷需要很長的時間進行修復(fù)[5-8]。因此，需要外界干預(yù)來促進下牙槽神經(jīng)的自我修復(fù)。

近年來發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，使筆者對利用這些生長因子促進神經(jīng)損傷修復(fù)產(chǎn)生了極大的興趣[9-10]。如人類神經(jīng)生長因子(human nerve growth factor beta，hNGFβ)對周圍神經(jīng)的損傷再生有很強的促進作用。筆者最近證明在兔下頜骨牽張成骨模型中在神經(jīng)損傷部位局部注射hNGFβ可以明顯地加速神經(jīng)的組織學(xué)修復(fù)[11-13]。然而，局部注射肽類藥物可能引起相應(yīng)神經(jīng)的二次醫(yī)源性損傷,而且由于其受體分布廣泛，在體內(nèi)半衰期短，不能有效通過血腦屏障，在腦內(nèi)很快降解，需要持續(xù)給藥維持效果，使其在臨床的應(yīng)用受到明顯限制?；蛑委熓且环N將編碼表達產(chǎn)物的遺傳物質(zhì)定向轉(zhuǎn)移到靶向器官或干細胞中的臨床治療手段[14-15]，慢病毒載體介導(dǎo)hNGFβ的表達已被證明是一種基于動物模型的基因治療方式[16-22]。因此，可以通過生產(chǎn)一種更加穩(wěn)定提供hNGFβ的經(jīng)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)來替代注射hNGFβ的方法修復(fù)神經(jīng)損傷。在本次實驗中，筆者目的是構(gòu)建一種hNGFβ基因修飾的MSC維持體內(nèi)分泌hNGFβ的正常生理水平，期望這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC可以有助于兔下頜骨牽張成骨中下牙槽神經(jīng)損傷的修復(fù)。

材料與方法

1構(gòu)建pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP質(zhì)粒

設(shè)計上游帶有酶切位點(NotI)、下游帶有HindIII的引物，以酵母雙雜交載體-人神經(jīng)生長因子(pCL1-hNGFβ)為模版擴增hNGFβ片段。NotI+HindIII雙酶切原始質(zhì)粒中hNGFβ片段后， NotI+HindIII雙酶切pDC316-mCMV-EGFP，回收線性化片段。將以上兩步產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定、酶切鑒定，構(gòu)建成pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP質(zhì)粒。

2兔下頜骨MSC的分離和培養(yǎng)

首先處死兔并分離出下頜骨，將其切割成為細碎的組織塊，然后加入3mg/mL膠原酶Ⅰ和4mg/mL分散酶Ⅱ 37 ℃水浴80min。使用細胞濾網(wǎng)(70μm) 進行過濾得到單細胞懸液，然后離心5min(500g)。將細胞接種于含有DMEM10%胎牛血清(FBS),抗生素(100U/mL鏈霉素，100U/mL青霉素)的混合培養(yǎng)液中以2×106100mm/皿的密度接種于培養(yǎng)皿中，于37℃ 5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后棄上清液，更換新的培養(yǎng)液。當(dāng)觀察到貼壁細胞生長接近融合時進行傳代培養(yǎng)，將經(jīng)過二次傳代培養(yǎng)的細胞用于接下來的實驗。

3慢病毒載體轉(zhuǎn)染MSC

將第二次傳代培養(yǎng)后的兔下頜骨MSC在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后,將pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP和pDC316-mCMV-EGFP質(zhì)粒加入到不同培養(yǎng)基中進行感染，感染復(fù)數(shù)為1000,100,10的比例。感染的過程需要進行2 000g 37℃1.5h的離心。將細胞用無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗然后接種在新的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)染48h后對細胞進行光學(xué)和熒光顯微觀察。用0.25%的胰蛋白酶消化分離細胞，之后500g離心5min。轉(zhuǎn)染后的MSC進行傳代培養(yǎng)。

4轉(zhuǎn)染后MSC的多向分化能力檢測

取各組的第4代MSC常規(guī)消化后，接種于35mm培養(yǎng)皿。待細胞達到80%左右融合時，分別更換成骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基(含B-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松等)及成脂誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組(未加誘導(dǎo)液的完全培養(yǎng)基)，每3d換液1次，誘導(dǎo)2周。4%多聚甲醛固定后分別行茜素紅或油紅染色，以顯示成骨或成脂能力。

5轉(zhuǎn)染后MSC hNGFβ表達的檢測

取轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)=100慢病毒轉(zhuǎn)染后3、5、7d的上清液進行hNGFβ的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測，hNGFβ ELISA試劑盒的使用參照制造商的操作說明書。

6動物實驗和手術(shù)

本動物實驗協(xié)議經(jīng)由第四軍醫(yī)大學(xué)動物科研和教學(xué)應(yīng)用委員會批準(zhǔn)。本次試驗共使用20只發(fā)育成熟的2.7～3.4kg雄性新西蘭白兔。動物模型細節(jié)在相關(guān)文獻中介紹[12-13]。對所有的實驗兔麻醉、鎮(zhèn)痛。使用特制的牽張器，小心實施手術(shù)操作，使固定器插入處遠離下頜管2mm，以防對下牙槽神經(jīng)的損傷。經(jīng)過3.5d的延遲期后，以1mm/12h的速度逐漸牽張5d。將20只實驗兔隨機分為A、B兩組，每組各10只，兩組依次各自移植分別經(jīng)上述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC(5×106，0.1mL PBS)。兩組移植均在手術(shù)過程中通過骨切開縫在右側(cè)頜骨下牙槽神經(jīng)周圍實施，并且均在下頜骨左側(cè)對稱位置注射相同量(0.1mL)的PBS以作對照(圖1)。

7神經(jīng)的組織學(xué)分析和組織形態(tài)測定

14d后，處死所有兔，對組織進行固定。在牽張區(qū)域分離采集長度為9mm的下牙槽神經(jīng)標(biāo)本。所有的標(biāo)本固定、酒精脫水后，以Epon包埋，制成1μm的切片，行甲苯胺藍染色。每2mm的神經(jīng)分別隨機挑選3張切片標(biāo)本在400倍光鏡下觀察。組織形態(tài)測定使用美國國家研究院的形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)，每個神經(jīng)標(biāo)本分別隨機選取12個區(qū)域(每個切片4個區(qū)域)進行。所有測定均由專業(yè)的實驗者盲法進行。最后計算有髓鞘神經(jīng)纖維的密度(單位/mm)。

8統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

1重組pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP轉(zhuǎn)染MSC后hNGFβ的表達

從兔下頜骨中分離出的骨髓MSC在相差顯微鏡下表現(xiàn)典型的梭形成纖維細胞樣形態(tài)并且貼附在培養(yǎng)皿表面生長(圖2a)。MOI 100(n=3)慢病毒感染后的MSC用熒光顯微鏡觀察顯示高表達的綠色熒光蛋白(圖2b)。綠色熒光蛋白表達在轉(zhuǎn)染MSC后的第15天仍然可以觀察到。對轉(zhuǎn)染后的MSC進行ELISA檢測證明轉(zhuǎn)染后MSC分泌的hNGFβ在轉(zhuǎn)染3d后達到10ng/mL水平，并在轉(zhuǎn)染后第5天和第7天上升到25ng/mL。在此ELISA檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上之后所有的試驗均選擇使用MOI=100(n=3)慢病毒感染。

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圖2從兔下頜骨中分離出的骨髓MSC培養(yǎng)后及其經(jīng)pDC316-hNGFβ-mCMV-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光蛋白的表達。a.從兔下頜骨中分離出的骨髓MSC在相差顯微鏡下表現(xiàn)典型的梭形成纖維細胞樣形態(tài)并且貼附在培養(yǎng)皿表面生長;b.經(jīng)慢病毒MOI=100轉(zhuǎn)染后的MSC在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達

2轉(zhuǎn)染后MSC的多向分化能力檢測見圖3。

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圖3a.MSC成骨誘導(dǎo)后形成的鈣結(jié)節(jié)經(jīng)茜素紅染色顯示為紅色(×100)；b.成脂誘導(dǎo)后油紅染色示細胞內(nèi)脂肪顆粒(×400)

3神經(jīng)的組織學(xué)分析和組織形態(tài)測定

20只兔均可以耐受實驗過程。神經(jīng)組織學(xué)分析顯示B組發(fā)生包括神經(jīng)脫髓鞘、髓鞘裂解在內(nèi)的神經(jīng)退行性變化，且只有少量的神經(jīng)纖維再生；相反，A組則可以觀察到大量的再生神經(jīng)纖維和少量的分解髓鞘殘骸。神經(jīng)組織形態(tài)定量顯示A組的有髓鞘神經(jīng)纖維密度明顯高于B組(P<0.05,圖4)。B組下頜骨左右兩側(cè)神經(jīng)組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)定量顯示沒有明顯差異。

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圖4實驗組和對照組兔下牙槽神經(jīng)組織形態(tài)分析。a.甲苯胺藍染色×400 熒光顯微鏡觀察，圖示比例尺為1μm;b.神經(jīng)組織形態(tài)定量顯示有髓鞘神經(jīng)纖維密度(P<0.05)

討論

下牙槽神經(jīng)損傷在臨床實踐中是一個重要的問題，在許多不同的動物牽張成骨模型中都發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)組織學(xué)和功能的改變[5-8,22-23]。本組兔下頜骨牽張術(shù)中，下牙槽神經(jīng)的病理學(xué)改變是因為骨牽張過程中的張力造成的。筆者嘗試直接注射或提供可注射原料等維持 hNGFβ的方法來幫助下牙槽神經(jīng)的修復(fù)[12-13]，但會產(chǎn)生對下牙槽神經(jīng)的二次損傷，并且注射藥物半衰期較短，只能保持1～3d的活性，而預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷在2周內(nèi)的修復(fù)是最關(guān)鍵的，體外注射維持 hNGFβ水平的方法還不能滿足臨床需求?；诖藛栴}，在本次研究中筆者成功構(gòu)建了hNGFβ基因修飾的質(zhì)粒，并通過慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染骨髓MSC，通過這種方法使得MSC可以自行分泌hNGFβ；之后，筆者在牽張成骨過程中局部應(yīng)用hNGFβ基因修飾的MSC以此加快了牽張術(shù)后造成的下牙槽神經(jīng)損傷的修復(fù)，沒有出現(xiàn)任何因注射造成的二次神經(jīng)損傷。

腺病毒載體、單純皰疹病毒載體和慢病毒載體都是在動物神經(jīng)疾病和損傷模型中用于介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子基因表達的有效基因治療方法[16-22]。慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細胞中。大量文獻研究表明，慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長期表達的組織或細胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、巨噬細胞等。不僅如此，慢病毒經(jīng)常與保持目的基因在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定的表達有肯定的關(guān)聯(lián)[15-16，21]。

本實驗中筆者發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)的MSC在第7天仍然能夠使hNGFβ保持在生理水平，這說明hNGFβ基因已經(jīng)成功地整合到MSC的DNA中。動物牽張成骨模型中，在越來越大牽張力的作用下在牽張末期神經(jīng)表現(xiàn)出最嚴重的水腫和缺血。NGF在加快施萬細胞的激活和增殖及指導(dǎo)神經(jīng)軸突的修復(fù)和髓鞘再生方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。所以在牽張期末期和固定期初始很可能是NGF水平不足，難以維護和再生神經(jīng)的關(guān)鍵時間。因此，將慢病毒轉(zhuǎn)染的MSC在手術(shù)中移植到體內(nèi)可以在牽張期末期和固定期初期提供足夠的外源性NGF，從而加速神經(jīng)纖維的再生。此項研究的主要目標(biāo)是研究牽拉應(yīng)力拉伸作用對神經(jīng)的軸性損傷，神經(jīng)軸性損傷與直接離斷等損傷在病理學(xué)方面有很大差別，而臨床中的DO神經(jīng)損傷大多都是軸性損傷；且人為損傷的神經(jīng)和DO牽張力造成的神經(jīng)損傷模式傷情不一致，恢復(fù)模式也不同，所以未將直接離斷等損傷形式列為分組因素。

總之，本研究證明了在牽張器植入時移植經(jīng)hNGFβ基因修飾的MSC能顯著加快兔下頜骨牽張術(shù)后下牙槽神經(jīng)的修復(fù)，經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的移植hNGFβ基因修飾的MSC基因治療有望將牽張成骨造成的神經(jīng)損傷和臨床上其他神經(jīng)損傷降到最低。

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(本文編輯： 黃利萍)

Nerve growth factor-modified mesenchymal stem cells in the acceleration of recovery of inferior alveolar nerve injury in rabbit mandibular distraction osteogenesis

ZHAOYing-hua1,LIUXiao-chang2,GAOLe2,CHENLi-tong2,YANGZi-hui2,WANGLei2

(1.Department of Prosthodontics,School of Stomatology,Xi’an Jiaotong University,Xi’an710004,China; 2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi’an710032,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of lentiviral-mediated human nerve growth factor beta (hNGFβ) on repair of inferior alveolar nerve (IAN) in mandibular distraction osteogenesis (DO) in rabbits. MethodsBone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) from rabbit mandibles were isolated and genetically engineered using recombinant lentiviral vector containing hNGFβ. Twenty New Zealand white rabbits underwent mandibular DO and transplantation of 5 million MSCs transduced with hNGFβ-vector or control vector around the IAN in the bone fracture gap during the surgery(n=10). After the distraction,IAN samples were collected for histological and quantitative analysis at the 14th day of consolidation period. ResultsIAN histology showed that the experiment group had more regenerating nerve fibers and less nerve degeneration than the control group. Quantitative analysis of nerve morphology showed that the density of myelinated nerve fibers increased significantly compared with the control group. This indicated that the MSCs transduced with hNGFβ could significantly promote IAN repair during mandiblar DO. ConclusionLentiviral-mediated transduction with hNGFβ in MSCs may provide an effective gene therapy for reduction of nerve injury in mandibular DO clinically.

【Key words】nerve injury; nerve growth factor; gene; mandibular bone; dental alveoli; rabbit

文章編號：1009-4237(2016)03-0168-04

基金資助：國家自然科學(xué)基金項目(81270015)

【中圖分類號】R 651

【文獻標(biāo)識碼】A【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.2016.03.013

(收稿日期：2014-10-13； 修回日期： 2015-09-10)

共同第一作者： 劉曉昌