劉田莉，孟慶玲，喬　軍，陳　誠，馬　玉，胡政香，才學鵬，陳創(chuàng)夫

(1 石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832003；2 中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

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細粒棘球蚴RTN4基因的克隆及序列分析

劉田莉1，孟慶玲1，喬軍1，陳誠1，馬玉1，胡政香1，才學鵬2，陳創(chuàng)夫1

(1 石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832003；2 中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

[摘要]【目的】 克隆細粒棘球蚴(Eg)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白4(Reticulon-4，RTN4)抗原基因，對其序列進行生物信息學分析。【方法】 采集感染Eg的綿羊肝臟和肺臟，提取Eg頭節(jié)總RNA為模板，對RTN4基因進行RT-PCR擴增，將PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體后測序，對其核苷酸序列及氨基酸序列進行生物信息學分析?！窘Y(jié)果】 Eg RTN4 cDNA全長654 bp，編碼217個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為25.3 ku，等電點為8.83。編碼氨基酸序列中含有1個N端酰基化位點、2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和4個蛋白激酶C磷酸化位點。經(jīng)生物信息學軟件預(yù)測，RTN4蛋白的抗原表位區(qū)主要集中在第1-47位、第71-147位和第171-217位區(qū)域；含有2個高度疏水區(qū)，2個跨膜區(qū)，膜外區(qū)分別位于第1-47位和第171-217位。【結(jié)論】 成功克隆了Eg RTN4基因，預(yù)測了其編碼蛋白抗原的結(jié)構(gòu)和表位。

[關(guān)鍵詞]細粒棘球蚴；抗原基因；基因克?。簧镄畔W分析

細粒棘球蚴病(Echinococcosis)是由中絳期細粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus,Eg)寄生于人和其他中間宿主的肝、肺、腹腔等內(nèi)臟器官形成機械性壓迫，造成不同程度的組織損傷和功能障礙，同時可導(dǎo)致過敏反應(yīng)引起死亡的一種人畜共患寄生蟲病[1-4]。由幼蟲棘球蚴引起的棘球蚴病，又稱為包蟲病，呈世界性分布。我國是包蟲病發(fā)病率較高的國家之一。據(jù)1999年全國包蟲病防治研討會統(tǒng)計資料，我國現(xiàn)有50萬包蟲病例，僅新疆平均每年需手術(shù)治療的病例就在2 000例以上，可見包蟲病嚴重危害著我國西部農(nóng)牧民的健康。因此，研發(fā)有效的包蟲病診斷試劑和疫苗一直是包蟲病防控研究的熱點[5-7]。

篩選具有免疫原性的抗原蛋白是研發(fā)Eg重組免疫診斷試劑和亞單位疫苗的前提[8-12]。Eg的許多抗原基因可在六鉤蚴階段高效表達，如蛋白酶抑制劑基因、四跨膜蛋白(Tetraspanin,TSPAN)基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白(Reticulon,RTN)基因等，這些基因是重組免疫診斷抗原和亞單位疫苗研發(fā)的候選基因。人們在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了4個RTN亞蛋白家族：RTN1、RTN2、RTN3和RTN4，并在真核生物中發(fā)現(xiàn)了至少250個RTN樣蛋白[13]。隨著對RTN家族同源基因研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)其家族基因在骨骼肌、外周血白細胞、小腸、結(jié)腸等組織中都有表達，特別是RTN3和RTN4可表達于機體的各個組織，且不同的RTN4具有不同的生物學功能[14-15]。本研究根據(jù)已經(jīng)報道的Eg全基因組序列，設(shè)計特異性引物，通過RT-PCR技術(shù)對EgRTN4抗原基因進行擴增、克隆和測序，通過分子生物學軟件對其核苷酸及編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析，以期為Eg重組免疫診斷抗原和亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

綿羊Eg病料組織(肝臟和肺臟)采自新疆沙灣縣屠宰場，病料取回后立即凍存于-80 ℃冰箱。大腸桿菌(E.coli)菌株DH5α、PCR反應(yīng)試劑、pMD19-T載體和DNA Marker購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自諾維森(北京)生物科技有限公司；RNA pure Tissue Kit和SuperRT cDNA Kit購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2總RNA的提取

從Eg感染綿羊的肝臟和肺臟抽取Eg囊液于1.5 mL的EP管中，12 000 r/min離心10 min，收集上清液于-20 ℃保存，將含有原頭蚴的沉淀用北京康為世紀生物科技有限公司的RNA pure Tissue Kit提取總RNA，并用SuperRT cDNA Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的相關(guān)綿羊EgRTN4基因序列(GenBank登錄號：EG_04657)，采用Premier 5.0引物軟件設(shè)計特異性引物。上游引物p1：5′-ATGGCGTCTGATACTGTTGCG-3′，下游引物p2：5′-CTAGTTTTGCTTTTCCTTTTTAAG-3′。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4EgRTN4的RT-PCR擴增及克隆

PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上游引物(25 μmol/L)、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，ddH2O 36.8 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將 RT-PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，對擴增得到的PCR產(chǎn)物進行純化回收，并與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細胞，最后進行PCR驗證。將驗證正確的重組載體產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.5EgRTN4基因編碼氨基酸序列及生物信息學分析

用DNAMAN軟件確定基因cDNA的開放閱讀框序列，對GenBank中發(fā)表的EgRTN相關(guān)序列進行分析，并推導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)計算蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量、理論等電點。通過MotifScan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)預(yù)測蛋白的糖基化、磷酸化等修飾位點；通過Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質(zhì)的親水性與疏水性；采用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進行結(jié)構(gòu)域預(yù)測；通過SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行蛋白質(zhì)的信號肽預(yù)測。通過SOPMA(http://sopma. expasy.org/)和SWISS-MODEL(http://swissmodel. expasy.org/)對蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。采用DNAStar (Jameson Wolf方法)對蛋白的抗原表位進行預(yù)測。

2結(jié)果與分析

2.1EgRTN4基因的克隆

利用特異性引物擴增EgRTN4基因序列，經(jīng)1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所擴增的目的RT-PCR產(chǎn)物長度約為654 bp(圖1)。轉(zhuǎn)化后，隨機挑取單菌落，做菌液PCR篩選驗證，結(jié)果表明成功得到了陽性轉(zhuǎn)化子。

圖 1　Eg RTN4基因的RT-PCR擴增

2.2EgRTN4基因核苷酸及其編碼氨基酸序列分析

經(jīng)測序，EgRTN4 cDNA全長654 bp，編碼217個氨基酸。Eg RTN4蛋白分子質(zhì)量為25.3 ku，等電點理論值為8.83，含有1個N端?；稽c、2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和4個蛋白激酶C磷酸化位點(圖2)。利用網(wǎng)上在線工具預(yù)測Eg RTN4蛋白的疏水性，結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)其疏水性最大值為3.000，最小值為-3.000，含有2個較高的疏水區(qū)，推測其含有2個跨膜區(qū)，從疏水性/親水性總體來看，該蛋白疏水性區(qū)域明顯大于親水性區(qū)域。

2.3Eg RTN4蛋白的生物信息學分析

2.3.1跨膜區(qū)預(yù)測將EgRTN4編碼的氨基酸序列與NCBI上所公布的其他分離株RTN4序列進行BLAST比對，篩選出同源性較高的Eg國外分離株RTN4(CDJ23569.1)和Eg綿羊分離株RTN4 (EUB60463.1)。利用在線軟件對本研究Eg RTN4蛋白的跨膜區(qū)進行預(yù)測，并與上述2株的氨基酸序列跨膜區(qū)進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究Eg RTN4具有2個跨膜區(qū)，而RTN4(CDJ23569.1)有3個跨膜區(qū)，RTN4(EUB60463.1)有1個跨膜區(qū)(圖4)。對膜外區(qū)氨基酸的比較結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)，這3種蛋白具有較高的同源性，說明本研究Eg RTN4蛋白具有保守的膜外區(qū)

圖 2　Eg RTN4 cDNA核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3.2信號肽預(yù)測運用在線軟件對Eg RTN4進行信號肽預(yù)測，結(jié)果顯示，其C、S、Y值均不高于閾值(C為信號肽切點計分，S為信號肽位置計分，Y為綜合計分)，表明在Eg RTN4中沒有明顯的信號肽。

2.3.3二級及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測通過在線軟件預(yù)測，Eg RTN4蛋白的二級結(jié)構(gòu)中有α-螺旋(69.12%)、延伸鏈(5.99%)、β-轉(zhuǎn)角(1.84%)、無規(guī)則卷曲(23.04%)，無β-折疊片。由此可知，該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主(圖6-A)。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖6-B)顯示，該蛋白含有4個α-螺旋、12個延伸鏈和3個β-轉(zhuǎn)角。

2.3.4抗原表位預(yù)測利用DNAStar軟件對Eg RTN4氨基酸序列進行抗原表位預(yù)測分析，結(jié)果(圖7)顯示，Eg RTN4的抗原表位區(qū)主要集中于3個區(qū)域，分別是第1-47位、第71-147位和第171-217位。

2.4Eg RTN4與其他絳蟲RTN4氨基酸序列的同源性比較

將Eg RTN4編碼氨基酸序列在NCBI中進行blastp檢索，結(jié)果(圖8)顯示，Eg RTN4氨基酸序列與Eg國外分離株RTN4(CDJ23569.1)的同源性高達99%，與Eg綿羊分離株RTN4(EUB60463.1)的同源性為83%。

圖 3　Eg RTN4蛋白的疏水性分析

圖 4　Eg RTN4蛋白的跨膜區(qū)分析

圖 5　本研究Eg RTN4與RTN4(CDJ23569.1)和RTN4(EUB60463.1)蛋白膜外區(qū)氨基酸的比較

圖 6　Eg RTN4蛋白的二級結(jié)構(gòu)(A)和三級結(jié)構(gòu)(B)

圖 7　Eg RTN4蛋白的抗原表位

圖 8　Eg RTN4與其他分離株氨基酸序列的同源性比較

3討論

RTN家族廣泛存在于動物、植物和真菌等真核生物中，最初研究發(fā)現(xiàn)，RTN蛋白是神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的特異性蛋白(Neuroendocrine-specific protein,NSP)[14]，可作為神經(jīng)內(nèi)分泌細胞分化的標記，主要定位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，但是對于RTN家族蛋白在寄生蟲方面的生物學功能還不是很清楚。有研究表明，RTN家族產(chǎn)生于真核生物進化早期的內(nèi)膜系統(tǒng)建立階段，由早期富含內(nèi)含子的reticulon祖先衍化而來[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，寄生蟲的RTN在寄生蟲逃避和調(diào)控宿主免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要作用[12]。

研發(fā)新型診斷試劑和疫苗來預(yù)防控制我國牧區(qū)細粒棘球蚴病的流行具有重要的現(xiàn)實意義[17-20]。目前，RTN被認為是重組免疫診斷抗原和亞單位疫苗研發(fā)的候選基因。本研究從Eg原頭蚴中提取總RNA，通過RT-PCR技術(shù)獲得了RTN4的cDNA序列。利用生物信息學軟件對其編碼氨基酸序列進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Eg RTN4含有2個較高的疏水區(qū)和2個跨膜區(qū)，這與利用蛋白質(zhì)的親疏水性序列推測的跨膜結(jié)構(gòu)一致。通過對Eg RTN4膜外區(qū)氨基酸進行分析比較發(fā)現(xiàn)，本研究Eg RTN4與Eg國外分離株RTN4(CDJ23569.1)和Eg綿羊分離株RTN4(EUB60463.1)的膜外區(qū)氨基酸序列具有較高的同源性，推測Eg RTN4具有保守的膜外區(qū)。

本試驗克隆了EgRTN4抗原基因的cDNA序列，對其編碼氨基酸序列重要功能位點進行分析發(fā)現(xiàn)，Eg RTN4含有1個N端?；稽c、2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和4個蛋白激酶C磷酸化位點。其抗原表位區(qū)主要集中在3個區(qū)域，分別位于第1-47位、第71-147位和第171-217位。且膜外區(qū)是抗原表位集中區(qū)，說明Eg RTN4膜外區(qū)是高度保守的蛋白。

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Cloning and sequence analysis ofRTN4 gene ofEchinococcusgranulosus

LIU Tian-li1,MENG Qing-ling1,QIAO Jun1,CHEN Cheng1,MA Yu1,HU Zheng-xiang1,CAI Xue-peng2,CHEN Chuang-fu1

(1DepartmentofAnimalScienceAndTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China;2LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu730046,China)

Abstract:【Objective】 This study aimed to clone and carry out bioinformatics analysis on the sequence of an important antigen gene reticulon-4 (RTN4) gene of Echinococcus granulosus.【Method】 The total RNA was extracted by hydatid protoscolex from sheep liver and lung infected with Echinococcus granulosus.The open reading frame (ORF) sequence of RTN4 was then amplified by RT-PCR before being cloned into pMD19-T vector for bioinformation analysis of nucleotide sequence and coding sequence of amino acids.【Result】 The full cDNA of RTN4 gene contained 654 bp,encoding 217 amino acids.It had a molecular weight of 25.3 ku and the isoelectric point was 8.83.The coding sequence of amino acids had one N-acylation site,two casein kinase Ⅱ phosphorylation sites and four protein kinase C phosphorylation sites.The results of bioinformatics software prediction showed that RTN4 protein mainly had three parts of 1 to 47,71 to 147,and 171 to 217 with two highly hydrophobic regions and two transmembrane domains.The extracellular domains were at 1 to 47 and 171 to 217.【Conclusion】 The RTN4 gene of Eg was successfully cloned and the structure and antigen epitopes of its coding protein were predicted.

Key words:Echinococcus granulosus;antigen gene;gene cloning;bioinformatics analysis

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-02-0209:3710.13207/j.cnki.jnwafu.2016.03.003

[收稿日期]2014-08-07

[基金項目]國家公益性(農(nóng)業(yè))行業(yè)專項(201303037)；國家國際科技合作項目(2014DFR31310)；新疆自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目(XJGRI2014059)

[作者簡介]劉田莉(1992-)，女，河南商丘人，在讀碩士，主要從事動物寄生蟲研究。E-mail:liutianli910903@sina.com[通信作者]孟慶玲(1969-)，女，江蘇徐州人，教授，博士，主要從事寄生蟲分子生物學研究。E-mail:xjmqlqj@163.com

[中圖分類號]S852.73+4

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)03-0017-06