孫鵬，尹海波，常成棟，賈曉晴，邵飛

（1.沈陽市第七人民醫(yī)院 藥劑科，遼寧 沈陽 110003；2.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷(Dioscorea nipponica Maknio)的干燥根莖，又稱為穿地龍、穿龍骨、地龍骨、常山等[1]。被收載于2015年版中國藥典一部[2]。穿山龍中的甾體皂苷已經(jīng)成為甾體類激素藥物和抗冠心病皂苷類藥物的重要原料[3]，其總皂苷在改善冠脈循環(huán)、抗動脈粥樣硬化、預(yù)防心血管疾病等方面具有較強的藥理活性。同時多糖（polysaccharide）類成分具有較強的抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、提高免疫力作用[4]。

貪婪算法（greedy method）是一種采用逐步構(gòu)造最優(yōu)解的方法。在每個階段中都要作出一個看上去最優(yōu)的決策（在一定的標準下），決策一旦作出，就不可再更改。作出貪婪決策的依據(jù)稱為貪婪準則（greedy criterion）。研究發(fā)現(xiàn)該方法對藥材有效成分提取率的提高具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)應(yīng)用于穿山龍藥材提取的方式是回流提取，大量文獻資料顯示超聲對于中藥多糖物質(zhì)、皂苷類物質(zhì)的提取具有促進作用。有人認為由于穿山龍飲片較堅硬，植物細胞不易破碎，用超聲波法只能低限度地提取其中多糖，導(dǎo)致產(chǎn)品的獲得率和純度偏低[5-8]。本文依據(jù)貪婪算法，將超聲處理引入到穿山龍活性成分的提取中，改進現(xiàn)有的提取方法，實驗通過不同提取方式的對比加以驗證并結(jié)合顯微觀察和植物學中的相關(guān)知識提出低功率下超聲提取的動力模型，以此為基礎(chǔ)進一步探究了超聲強化回流提取應(yīng)用在穿山龍活性成分提取中的理論依據(jù)。

1　貪婪算法

考察時間對兩種活性成分提取率的影響，選取7個時間點進行實驗，結(jié)果見表1，2。權(quán)重法處理得到貪婪算法的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，結(jié)果見表3。對比每個時間段的數(shù)據(jù)，依據(jù)貪婪算法思路獲得：先進行超聲處15 min后改為回流提取的超聲強化回流提取法為最佳提取方式。

表1　提取時間與多糖提取率的關(guān)系(n=7)

表2　提取時間與總皂苷提取率的關(guān)系(n=7)

表3　不同提取方法的提取率的變化加權(quán)值與時間

2　材料與方法

2.1　實驗材料

穿山龍采自吉林省撫順清原南山城鎮(zhèn)，藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學尹海波教授鑒定為薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷（Dioscorea nipponica Makino）的干燥根莖，標本保存于遼寧中醫(yī)藥大學藥用植物教研室。

2.2　儀器試劑

儀器：紫外可見分光光度計 (UV24802型)、CP225D電子天平(德國Sartorius公司)、顯微鏡、超聲儀、恒溫水浴鍋、250 mL容量瓶、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

試劑：葡萄糖、濃硫酸、苯酚、高氯酸、乙醇(95%)、無水乙醇、氯仿等皆為分析純，重蒸水。

2.3　線性關(guān)系考察

2.3.1多糖線性范圍

干燥葡萄糖粉末至恒重，精密稱取26.81 mg，配得葡萄糖標準溶液。精密量取葡萄糖標準溶液0，5，10，15，20，25 mL 至 100 mL 容量瓶中稀釋，取各濃度的標準液1.0 mL分別置于試管中顯色，495 nm處測定其吸光度，以吸光度Y為縱坐標，葡萄糖含量X為橫坐標繪制標準曲線Y=9.391×10-3X-3.571×10-2，相關(guān)系數(shù) r=0.9994，線性范圍為 13.46～67.24μg。

2.3.2總皂苷線性范圍

精密稱取薯蕷皂苷元對照品4.14 mg，配制成0.1656 mg/mL對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 mL，揮干，顯色，置25℃水浴保溫25 min。以高氯酸為空白，在409 nm處測定吸光度，以吸光度Y為縱坐標，總皂苷含量X為橫坐標繪制標準曲線的線性方程Y=18.013×10-3X+1.4322×10-3，相關(guān)系數(shù) r=0.9999，線性范圍為 8.28μg～66.24μg。

2.4　供試品溶液的制備

依據(jù)貪婪算法中的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)設(shè)計實驗，按照不同的實驗方法對實驗進行編號。實驗Ⅰ：回流提取法（在90℃回流提取2 h的回流提?。?；實驗Ⅱ：超聲提取法（室溫恒溫超聲提取30 min）；實驗Ⅲ：超聲強化回流提?。ㄏ仁覝爻曁崛?5 min再90℃回流提取1 h）；實驗Ⅳ：回流輔助超聲提?。ㄏ?0℃回流提取1 h再室溫超聲提取15 min）；實驗Ⅴ：耦合提取（回流提取裝置于90℃超聲場中進行提?。?。

2.4.1多糖供試品制備

精密稱取穿山龍藥材粉末3.0 g（過40目篩），20倍體積75%乙醇，于150 mL圓底燒瓶中。分別采用Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ進行提取，過濾，殘渣用75%乙醇10 mL洗滌2次，合并提取液和洗液，蒸干，測得浸膏質(zhì)量。加適量體積蒸餾水加熱溶解，過濾，殘渣用10 mL蒸餾水洗滌2次，濾液于250 mL量瓶中定容。

2.4.2總皂苷供試品的制備

精密稱取藥材粉末3.0 g(過40目篩)，20倍體積75%乙醇置150 mL圓底燒瓶中，分別采用Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ進行提取，分別進行濾過，揮去溶劑，加一定量的濃度硫酸，超聲處理3 min（促進溶解），加熱回流，放冷，置分液漏斗中，再加三氯甲烷20 mL，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，用NaOH溶液洗至中性，減壓回收溶劑至干。殘渣加無水乙醇使溶解，轉(zhuǎn)移至20 mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5　含量與提取率的測定

2.5.1穿山龍多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法，吸取供試品溶液1.0 mL置25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。精密吸取1.0 mL至試管中，加1.0 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，迅速加5.0 mL濃硫酸，搖勻后反應(yīng) 15 min，置冷水中冷卻10 min，同時用 1.0 mL蒸餾水進行平行操作作空白，在波長 495 nm處測定吸光度。

多糖提取率計算如下：

2.5.2穿山龍總皂苷含量測定

精密吸取0.05 mL供試品溶液于10 mL比色管中，揮干溶劑，加高氯酸5 mL，置25℃水浴中保溫25 min，取出冷卻至室溫，以高氯酸為空白對照，測定吸光度，計算供試品中總皂苷提取率。

2.6　顯微觀察

從原藥材粉末經(jīng)5種不同提取方法提取后的粉末殘渣中取出實驗所用樣品，分別標記為A，B，C，D，E，F(xiàn)；取原藥材粉末（標記為G）進行對照觀察。同時用5點取樣法分別在6類樣品中進行取樣，每點精取 1.00 g， 標 記 為 Xi（X=A，B，C，D，E，F(xiàn)，G；i=1，2，3，4，5）分別過 80 目篩，稱取所得粉末質(zhì)量。將過篩后所得粉末用水合氯醛裝片進行顯微觀察。

3　結(jié)果與分析

3.1　化學分析結(jié)果(表4)

表4　理化試驗數(shù)據(jù)

3.2　顯微實驗結(jié)果

3.2.1視覺觀察

發(fā)現(xiàn)超聲強化回流提取的殘渣中微細粉末最多。不同方法提取后的殘渣較原粉末細微顆粒均有不同程度增加（圖1）。

3.2.2顯微觀察

觀察發(fā)現(xiàn)，幾種提取方法所得粉末殘渣中細胞的破碎程度不同，以超聲強化回流提取的細胞破碎程度最為嚴重。低功率超聲提取的殘渣中成片狀存在的薄壁細胞團數(shù)目與原藥材粉末無顯著差異，其它提取方法粉末殘渣中成片存在的薄壁細胞團數(shù)目基本多于5個，而超聲強化回流提取的殘渣中成片狀存在的薄壁細胞團較少，成片狀存在的薄壁細胞團多數(shù)情況下不足5個。說明超聲提取和回流提取的破壁效果都不太理想；超聲強化回流提取對粉末顆粒的破壁效果最明顯（圖2）。

圖1　幾種方法粉末殘渣直觀圖A回流提取的粉末殘渣；B超聲提取的粉末殘渣；C超聲強化回流提取的粉末殘渣；D回流輔助超聲提取的粉末殘渣；E超聲耦合回流提取粉末；F原藥材粉末

圖2　幾種方法粉末殘渣顯微圖A回流提取的粉末殘渣切片；B超聲提取的粉末殘渣切片；C超聲強化回流提取的粉末殘渣切片；D回流輔助超聲提取的粉末殘渣切片；E超聲耦合回流提取的粉末切片；F原藥材粉末切片

3.2.3定量分析

定量分析結(jié)果顯示超聲強化回流提取的殘渣中可過80目篩的粉末重量遠遠高于其他提取方法，超聲強化回流提取的粉末殘渣中顆粒較細（圖3）。

4.提取模型建立及驗證

圖3　不同提取方法破壁率定量示意圖

σ0為超聲前的顆粒力度，t為提取時間，為常量則低功率超聲條件下的中草藥浸提模型為：

對于確定的藥材，α，β均為常數(shù)，K為二階浸出速率常數(shù) g·(mL·min)-1。

低功率超聲提取與回流提取交叉應(yīng)用的提取模型為：

x，y為矢量，與提取條件有關(guān)，x≥y與x＜y可表示不同的提取方式：x≥y表示優(yōu)先進行超聲處理，x＜y表示優(yōu)先進行回流處理；z為標量，與藥材、目標成分等的性質(zhì)有關(guān)。

D為擴散系數(shù)，與擴散體系的物質(zhì)性質(zhì)、溫度以及擴散面處的物質(zhì)濃度等因素有關(guān)。

ca為溶出飽和度，即飽和時該有效成分的濃度g·mL-1；c1為t時間溶液中該有效成分濃度g·mL-1。顆粒數(shù)目ω、溶劑的倍量M。

將表4中實驗數(shù)據(jù)代入交叉提取模型中均出現(xiàn)：當存在x＞y時可以得到函數(shù)的最優(yōu)解集。

因此對于穿山龍活性成分提取的最佳提取方式為超聲強化回流提取。

5　實驗結(jié)果解析

理化實驗結(jié)果顯示：在對穿山龍活性成分提取中超聲強化回流提取在明顯縮短了提取時間的同時，又明顯提高了活性成分提取率，超聲強化回流的提取效果優(yōu)于其他提取方法。

顯微實驗結(jié)果顯示，超聲強化回流提取的破壁率明顯高于其余提取方法，為模型建立時的理論基礎(chǔ)提供了事實依據(jù)，證實了低功率超聲提取模型的理論解釋的正確性，進一步證實了貪婪算法應(yīng)用于藥材提取優(yōu)化改良的可行性和合理性。

6　討論

加熱條件下不均勻介質(zhì)中的聲場會發(fā)生畸形變化，而畸形聲場的存在使得現(xiàn)有的超聲提取的動力學模型存在著很大的不足，對于提取方案按照NPC(non-deterministic polynomial complete)問題探究及以此建立的提取模型尚處于初級研究階段；且中藥中的植物藥材的個體差異很大，暫無法對低功率超聲強化回流提取的基本模型進一步優(yōu)化。本實驗以貪婪算法為指導(dǎo)以實驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合顯微觀察建立了新的提取模型理論，完成了低功率超聲強化回流提取方法的初步研究，實現(xiàn)了對傳統(tǒng)提取方式的改良優(yōu)化，證實了貪婪算法在藥材提取中應(yīng)用的合理性。

實驗結(jié)果與所建立的低功率超聲提取模型計算結(jié)果以及貪婪算法的預(yù)測結(jié)果一致，模型作為提取動力學機理的拓展具有實際意義。超聲強化回流提取，對穿山龍活性成分提取效果好于單一的回流提取，且提取時間短提取效率高，破壁率遠好于單一的回流提取法。在穿山龍活性成分提取中超聲強化回流提取是一種新的綠色高效的提取方法。貪婪算法在藥材提取優(yōu)化改良中具有可行性。