馬興龍,黃俞霖,陳曉晴,李明強,劉清蒙△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，貴州遵義 563002；2.遵義醫(yī)學(xué)院2011級檢驗專業(yè)本科生，貴州遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院微生物教研室，貴州遵義 563099)

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SpA刺激單核巨噬細(xì)胞表達(dá)早期致炎因子的實驗研究*

馬興龍1,黃俞霖2,陳曉晴2,李明強3,劉清蒙3△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，貴州遵義 563002；2.遵義醫(yī)學(xué)院2011級檢驗專業(yè)本科生，貴州遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院微生物教研室，貴州遵義 563099)

[摘要]目的探討金黃色葡萄球菌蛋白A(SpA)對單核巨噬細(xì)胞表達(dá)早期致炎因子TNF-α、IL-1和IL-6的影響。方法用一定濃度SpA與THP-1細(xì)胞培養(yǎng)不同時間，用MTT法測定SpA對THP-1細(xì)胞增殖的影響；用ELISA 測定培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1和IL-6的水平；用RT-PCR檢測細(xì)胞TNF-α、IL-1和IL-6相應(yīng)mRNA的表達(dá)，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果SpA對THP-1細(xì)胞增殖的影響與其作用劑量有關(guān)。SpA可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1和IL-6及表達(dá)相應(yīng)mRNA，且呈一定劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系。SpA刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1、IL-6和表達(dá)相應(yīng)mRNA 均在12 h達(dá)高峰。SpA刺激組TNF-α、IL-1和IL-6 的表達(dá)和釋放均顯著升高(P<0.01)。結(jié)論SpA可明顯促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌早期致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6。SpA在啟動金葡菌性膿毒癥及促進(jìn)其發(fā)展中，具有不可忽視的作用。

[關(guān)鍵詞]金黃色葡萄球菌蛋白A；THP-1；腫瘤壞死因子；白細(xì)胞介素-1；白細(xì)胞介素-6

膿毒癥(Sepsis)是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征。進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。MODS是導(dǎo)致膿毒癥患者多器官衰竭和死亡的主要原因，其發(fā)生率在世界范圍內(nèi)仍然呈上升趨勢，病死率依然居高不下[1-2]。全球發(fā)起拯救膿毒癥運動(surviving sepsis campaign，SSC)，以及SSC指南希望能提高膿毒癥的搶救成功率[3]。

鑒于MODS發(fā)病特點是繼發(fā)性、順序性和進(jìn)行性，一旦啟動，必然按一定順序進(jìn)行，因此，啟動膿毒癥的早期致炎細(xì)胞因子備受基礎(chǔ)和臨床研究者重視[4-7]。單核巨噬細(xì)胞(macrophage,Mф)在抗感染免疫應(yīng)答過程中可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和(或)誘導(dǎo)炎癥的致炎因子，特別是早期致炎細(xì)胞因子[8-9]。Mф在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。

近年，耐藥金葡菌性膿毒癥明顯增加，對臨床防治增加了巨大難度[10-11]。金黃色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SpA)是金葡菌細(xì)胞表面抗原，可刺激多種免疫細(xì)胞活化，分泌活性細(xì)胞因子，包括巨噬細(xì)胞分泌致炎細(xì)胞因子。文獻(xiàn)顯示[12]，SpA與腫瘤壞死因子受體1(TNF-R1)結(jié)合，發(fā)揮TNF樣作用，啟動TNF信號級聯(lián)放大反應(yīng)，發(fā)揮促炎效應(yīng)。本文就SpA刺激對Mф表達(dá)早期致炎細(xì)胞因子的影響進(jìn)行了初步探討。

1材料與方法

1.1材料人Mф株。按本室常規(guī)將THP-1細(xì)胞株放入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，加入 PMA(終濃度100 ng/mL)，培養(yǎng)24 h后，貼壁細(xì)胞即為Mф。臺盼蘭染色活細(xì)胞數(shù)大于95% 。

1.2方法

1.2.1SpA的制備標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌菌株(S1800)由本室保存，按本室常規(guī)制備粗提SpA,并與購買純化SpA比較，實驗效果相一致。本實驗均采用自提SpA。

1.2.2THP-1細(xì)胞增殖的測定取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×105/mL，接種96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)12 h；加入不同濃度SpA，孵育24 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。1 000 r/min，棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床低速振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm測量吸光值。

1.2.3TNF-α、IL-1和IL-6的測定用雙抗夾心法ELISA測定培養(yǎng)上清液中 TNF-α、IL-1、IL-6 的水平,試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，具體操作嚴(yán)格按檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4TNF-α、IL-1、IL-6 mRNA的檢測用RT-PCR法檢測培養(yǎng)細(xì)胞TNF-α、IL-1、IL-6 mRNA表達(dá)水平，試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，具體操作嚴(yán)格按檢測試劑盒說明書進(jìn)行。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。內(nèi)參基因GAPDH，目的基因TNF-α、IL-1、IL-6擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，再次延伸72 ℃ 7 min，預(yù)變性、變性和退火循環(huán)30次，延伸72 ℃ 45 s，4 ℃保存。

2結(jié)果

2.1PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞株轉(zhuǎn)化為Mф使用PMA與THP-1細(xì)胞株共育24 h后，誘導(dǎo)使其轉(zhuǎn)化為Mф，顯微鏡下觀察可見細(xì)胞由懸浮生長變?yōu)橘N壁生長，見圖1。

A：刺激前；B:刺激后。

圖1PMA刺激前、后的細(xì)胞

2.2SpA對Mф增殖的影響SpA刺激THP-1細(xì)胞株24 h后,細(xì)胞增殖明顯增加，見表1、圖2。

表1　SpA對Mф增殖的影響

2.3SpA濃度對Mф分泌TNF-α、IL-1和IL-6的影響不同濃度SpA與Mф 孵育12 h后，取培養(yǎng)上清液測定TNF-α、IL-1和IL-6的水平，結(jié)果呈現(xiàn)一定的劑量和時間效應(yīng)關(guān)系。SpA 刺激組與空白組相比，TNF-α、IL-1和IL-6的水平明顯升高(P<0.05)，100與500 μg/mL SpA 組間無明顯差異(P>0.05)，見表2、圖3。

圖2　SpA對Mф增殖的影響

SpA(μg/mL)TNF-αIL-1IL-60127.23±11.8347.19±4.8619.26±2.511201.53±9.5850.72±4.5319.86±2.8110214.67±8.3761.74±5.7727.35±3.56100248.81±9.2481.01±4.8935.27±3.76500246.78±9.3180.51±6.3345.62±4.32

圖3　SpA水平對Mф分泌細(xì)胞因子的影響

2.4SpA刺激時間對Mф分泌TNF-α、IL-1和IL-6的影響用100 μg/mL SpA與Mф胞孵育6、12、24、48 h后取上清液，測定TNF-α、IL-1和IL-6的水平。結(jié)果顯示SpA刺激組TNF-α、IL-1和IL-6的水平顯著升高(P<0.01)，約12 h達(dá)到高峰(P<0.01)，12、24與48 h組間比較無明顯差異(P>0.05)，見表3、圖4。

表3　SpA刺激時間對Mф分泌TNF-α、IL-1和IL-6的影響

2.5SpA刺激水平對Mф表達(dá)TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA的影響用10 μg/mL SpA與Mф孵育12 h，測定沉淀細(xì)胞TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA水平。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，圖像經(jīng)Bandscan軟件進(jìn)行密度分析，以目的基因電泳條帶總灰度值與β-actin電泳條帶總灰度值之比(RQ)作為目的基因mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示SpA刺激組TNF-α、L-1和IL-6 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，100 μg/mL與500 μg/mL組間無明顯差異(P>0.05)，見表4、圖5。

圖4　SpA刺激時間對Mф分泌細(xì)胞因子的影響

表4　SpA濃度對Mф表達(dá)細(xì)胞因子 mRNA的影響

圖5　SpA刺激濃度對Mф表達(dá)細(xì)胞因子mRNA的影響

2.6SpA刺激時間對Mф表達(dá)TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA的影響結(jié)果顯示SpA刺激組在各時間點均高于空白組，且于12 h達(dá)到高峰(P<0.01)，12 h與24 h和 48 h組間無明顯差異(P>0.05),見表5，圖6、7。

表5　SpA刺激時間對Mф表達(dá)TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA的影響

圖6　SpA刺激時間對Mф表達(dá)細(xì)胞因子mRNA的影響

圖7　SpA刺激Mф表達(dá)TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA 凝膠電泳圖

3討論

早期致炎細(xì)胞因子能啟動膿毒癥按順序性、進(jìn)行性，甚至是不可逆性方向發(fā)展。因此，深入研究致炎細(xì)胞因子與膿毒癥的確切發(fā)病機制，尋找防治膿毒癥的新靶點，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)亟待解決的重要課題。

SpA是金葡菌表面蛋白抗原，可激活多種免疫細(xì)胞表達(dá)和釋放多種與炎癥相關(guān)因子，特別是Mф表達(dá)和釋放的早期致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6。TNF-α 可使血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變，造成微循環(huán)血栓形成及組織損傷。IL-1為多功能細(xì)胞因子，其與相應(yīng)受體結(jié)合，觸發(fā)早期感染免疫應(yīng)答，導(dǎo)致組織損傷，具有促進(jìn)炎癥的作用。IL-6 被認(rèn)為與SIRS 的嚴(yán)重程度和致死率密切相關(guān)，它除對血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞具有直接的激活和毒性作用外，更主要是催化和放大炎性反應(yīng)和毒性作用，造成組織細(xì)胞的損害[13-15]。因此，TNF-α、IL-1和IL-6 是機體炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過程中的重要介質(zhì)，作為早期致炎因子，在啟動SIRS，誘導(dǎo)MODS中扮演極其重要的角色。

本實驗結(jié)果顯示，不同濃度SpA與THP-1細(xì)胞株共育24 h后，THP-1細(xì)胞增殖明顯增加，與對照組比較有顯著差異(P<0.05)。SpA 濃度為100 μg/mL時，刺激細(xì)胞增殖作用達(dá)高峰，而100 μg/mL與500 μg/mL SpA組結(jié)果無明顯差異(P>0.05)，表明SpA在一定濃度范圍內(nèi)可明顯增強THP-1細(xì)胞增殖。用PMA將THP-1誘導(dǎo)為Mф后，與不同濃度的SpA共同孵育一定時間，測定上清液中TNF-α、IL-1和IL-6的量。SpA濃度為100 μg/mL時Mф分泌TNF-α、IL-1和IL-6達(dá)高峰，提示SpA須達(dá)到一定的濃度才具備促進(jìn)細(xì)胞因子分泌的作用。SpA刺激Mф 6 h就可使培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1和IL-6的水平升高，12 h達(dá)高峰，與對照組比較，有顯著差異(P<0.01)，12 h 與24 h相比，無明顯差異(P>0.05)，表明SpA促進(jìn)TNF-α、IL-1和IL-6的分泌遵循一定的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系，且在釋放細(xì)胞因子的時間點上符合早期致炎細(xì)胞因子的特點。Mф表達(dá)TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA水平的實驗結(jié)果與上述實驗結(jié)果相一致，100 μg/mL SpA可明顯促進(jìn)TNF-α、IL-1和IL-6相應(yīng)mRNA的表達(dá)，與對照組相比，有顯著差異(P<0.01)，且其促進(jìn)作用遵循一定的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系，即在一定劑量和時間內(nèi)，SpA可明顯增強Mф表達(dá)TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA。

本實驗表明SpA可刺激Mф表達(dá)和釋放大量早期致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6。SpA在啟動金葡菌性膿毒癥中，應(yīng)具有不可忽視的作用。本報道為實驗室研究，SpA在體內(nèi)如何參與啟動膿毒癥尚待深入研究。

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Effect of staphylococcal protein A on pro-inflammatory cytokines expression in mononuclear macrophage*

Ma Xinglong1,Huang Yulin2,Chen Xiaoqing2,Li Mingqiang3,Liu Qingmeng3△

(1.Department of ICU,the Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563002,China;2.Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563099,China;3.Department ofMicrobiology,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563099,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the expression and regulation of pro-inflammatory cytokinesTNF-α,IL-1,IL-6 in mononuclear macrophages stimulated with staphylococcal protein A (SpA).MethodsTHP-1 was incubated with PMA and induced into mononuclear macrophages.Then the macrophages were incubated with varying concentrations of SpA under different time points.The effect of SpA on macrophage proliferation was measured by MTT method.The levels of inflammatory cytokines,TNF-α,IL-1 and IL-6 from the cultured cell media were measured by ELISA respectively.The levels of mRNA expression corresponding to TNF-α,IL-1 and IL-6 were detected by RT-PCR from the macrophages stimulated with SpA.All statistical analyses were performed by SPSS17.0 software.ResultsThe MTT result indicated that SpA had a positive effect on the proliferation of THP-1 cells in a dosage depended manner.The addition of SpA could enhance the mRNA expression of TNF-α,IL-1 and IL-6 in the stimulated macrophages.It also showed a specific dose-effect and time-effect correlation.The macrophages secreted inflammatory cytokines and its corresponding mRNA reached its peak levels at 12 h post stimulation.Compared with the control group,the expression and release of TNF-α,IL-1 and IL-6 in macrophages from the experimental group was increased with statistical significance(P<0.01).ConclusionSpA can promote the secretion and expression of early pro-inflammatory cytokines,such as TNF-α,IL-1 and IL-6 in macrophages.Therefore,SpA plays a very important role in the initiation and development of the staphylococcus aureus sepsis.

[Key words]staphylococcal protein A;THP-1；tumor necrosis factor-alpha；interleukin-1；interleukin-6

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.013

* 基金項目：貴州省大學(xué)生創(chuàng)新課題(201413653004)。

作者簡介：馬興龍(1972-)，副主任醫(yī)師，在職碩士，主要從事膿毒癥研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:2446545484@qq.com。

[中圖分類號]R378.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)11-1484-04

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-01-16)