安　樂　焦曉輝　米　娜　郝嫣汝　宋紅權(quán)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，哈爾濱150000)

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MTHFR基因多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂的相關(guān)性研究

安樂①焦曉輝①米娜郝嫣汝宋紅權(quán)②

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，哈爾濱150000)

[摘要]目的：探討5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂(NSCLP)遺傳易感性的相關(guān)性。方法：選取2014年6月至2015年5月在我院治療的NSCLP患者100例(病例組A),其中單純性腭裂(CPO組)23例，唇裂伴或不伴腭裂(CL/P組)77例；同時選取100名正常兒童(對照組A)、100名生育過NSCLP患兒母親(病例組B)和100名正常出生兒母親(對照組B)，采用聚合酶聯(lián)式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性基因分型技術(shù)檢測各組MTHFR基因C677T突變。結(jié)果：病例組A中，CL/P組C、T等位基因頻率為55.84%和44.16%，CPO組分別為54.35%和45.65%，對照組A分別為75.00%和25.00%，CL/P組和CPO組T等位基因頻率明顯高于對照組A，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CT基因型個體患CL/P的風(fēng)險是CC基因型個體的2.39倍，患CPO的風(fēng)險是CC基因型個體的2.98倍；TT基因型個體患CL/P的風(fēng)險是CC基因型個體的6.70倍，患CPO的風(fēng)險是CC基因型個體的7.33倍；病例組B和對照組B的等位基因頻率和基因型構(gòu)成情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：MTHFR基因C677T突變可能是NSCLP發(fā)生的遺傳危險因素之一，但母親MTHFR基因C677T突變可能與子代發(fā)生NSCLP無關(guān)。

[關(guān)鍵詞]MTHFR基因；NSCLP；相關(guān)性；等位基因

唇腭裂是人類較為常見的先天性發(fā)育畸形之一，臨床上根據(jù)胚胎學(xué)發(fā)育時期的不同致畸機(jī)制，往往將非綜合征性唇腭裂分為單純性唇腭裂和唇裂伴或者不伴腭裂。相關(guān)臨床統(tǒng)計可見非綜合征性唇腭裂占到了唇腭裂發(fā)生的75%左右[1]，但相關(guān)病因研究尚無明確進(jìn)展，迄今位置多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，唇腭裂的發(fā)病主要為環(huán)境因素與遺傳因素相互作用的結(jié)果[2,3]。相關(guān)國外文獻(xiàn)報道認(rèn)為，孕婦在孕早期葉酸攝入不足會使得胎兒發(fā)生非綜合癥型唇腭裂的幾率增加，同時妊娠三個月內(nèi)服用葉酸拮抗劑如甲氨蝶呤或者苯妥英鈉均會不同程度的增加新生兒非綜合型唇腭裂的發(fā)生[4,5]，提示了葉酸缺乏是導(dǎo)致非綜合型唇腭裂的重要原因，本次臨床研究重在分析5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂(NSCLP)遺傳易感性的相關(guān)性，具體研究如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象選取2014年6月至2015年5月在我院治療的非綜合征性唇腭裂(NSCLP)患者100例(病例組A)，其中男性58例，女性42例；年齡4個月～18歲，平均(4.71±2.02)歲；其中單純性腭裂(CPO組)23例，唇裂伴或不伴腭裂(CL/P組)77例，其中雙側(cè)CL/P 17例，單側(cè)CL/P 60例。排除綜合性唇腭裂或其他系統(tǒng)畸形。病例組B：選取100名生育過NSCLP患兒母親，年齡23～38歲，平均年齡(28.13±4.58)歲，排除惡性腫瘤、心腦血管方面等疾病。對照組A：選取100名正常兒童，其中男性60例，女性40例，年齡2月～17歲，平均年齡(5.02±2.51)歲，排除其他先天性畸形。對照組B：選取100名正常出生兒母親，年齡22～38歲，平均年齡(28.01±5.21)歲，排除惡性腫瘤、心腦血管方面等疾病。此次實驗通過院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，血液標(biāo)本在研究對象或在其家長的知情同意的前提下獲得。

1.1.2儀器和試劑tapDNA聚合酶購自立陶宛MBI公司，hinfⅠ、MboⅡ限制性內(nèi)切酶購自立陶宛MBI公司，2700型PCR購自美國ABI公司，APPLIGENE垂直電泳槽、H6-1微型電泳槽購自上海福馬實驗設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法將收集到的5 ml全血，ACD抗凝，提取基因組DNA，應(yīng)用primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物、內(nèi)切酶，對于兩個位點(diǎn)進(jìn)行內(nèi)切，分別應(yīng)用PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶MAV1、DdeⅠ酶切，產(chǎn)物電泳后進(jìn)行基因分型。為了驗證基因分型正確性，隨機(jī)挑選10%的樣本直接測序，同時設(shè)立陽性對照炎癥內(nèi)切酶的正確性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，C677T基因型及等位基因頻率使用χ2檢驗，C677T基因型與NSCLP相關(guān)性采用優(yōu)勢比表示。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1C677T多態(tài)性電泳結(jié)果DNA片段擴(kuò)增后長度為198 bp，若發(fā)生C→T突變，則產(chǎn)生HinfⅠ酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生175 bp和23 bp片段。純和突變型(TT)產(chǎn)生175 bp，23 bp兩個DNA片段，雜合子(CT)產(chǎn)生198、175、23 bp三個DNA片段，野生型(CC)只用198 bp一個DNA片段。以標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker為參照，在電泳圖譜上可看到CC基因型、CT基因型和TT基因型，見圖1。

2.2病例組A與對照組A C677T基因型和等位基因頻率比較病例組A中，CL/P組C、T等位基因頻率為55.84%和44.16%，CPO組分別為54.35%和45.65%，對照組A分別為75.00%和25.00%，CL/P組和CPO組T等位基因頻率明顯高于對照組A，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.367、7.769，P<0.05)；CT基因型個體患CL/P的風(fēng)險是CC基因型個體的2.39倍，患CPO的風(fēng)險是CC基因型個體的2.98倍；TT基因型個體患CL/P的風(fēng)險是CC基因型個體的6.70倍，患CPO的風(fēng)險是CC基因型個體的7.33倍。見表1。

圖1　MTHFR基因C677T多態(tài)性電泳結(jié)果Fig.1　MTHFR gene C677T polymorphic electrophor-esis resultsNote: 3-6.CC genotype;1,2,8.CT genotype;7.TT genotype;M.Standard molecular weight Marker.

表1病例組A與對照組A C677T基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

Tab.1Case group A and control group A C677T genotype and allele frequency comparison[n(%)]

GroupnGenotypefrequencyCCCTTTAllelefrequencyCTCasegroupA10032(32.00)54(54.00)14(14.00)118(59.00)82(41.00)CL/Pgroup7723(29.87)40(51.95)14(18.18)86(55.84)68(44.16)CPOgroup236(26.09)13(56.52)4(17.39)25(54.35)21(45.65)ControlgroupA10055(55.00)40(40.00)5(5.00)150(75.00)50(25.00)

表2病例組B與對照組B C677T基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

Tab.2Case group B and control group B C677T genotype and allele frequency comparison[n(%)]

GroupsnGenotypefrequencyCCCTTTAllelefrequencyCTCasegroupB10043(43.00)47(47.00)10(10.00)133(66.50)67(33.50)ControlgroupB10039(39.00)50(50.00)11(11.00)128(64.00)72(36.00)

2.3病例組B與對照組B中C677T基因型和等位基因頻率比較病例組B的C、T等位基因頻率分別為66.50%和33.50%，對照組B的等位基因頻率分別為64.00%和36.00%，差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.276，P>0.05)；兩組基因型構(gòu)成情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.336，P>0.05)。見表2。

3討論

近年來隨著先天性唇腭裂相關(guān)研究的進(jìn)展，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，先天性基因易感性以及環(huán)境因素獨(dú)立以及相互作用的方式，均可能較為顯著地參與到了先天性唇腭裂特別是非綜合型唇腭裂的發(fā)生中[6]。筆者通過回顧國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究著重探討了基因水平的變異或者易感基因的先天性獲得對于唇腭裂的發(fā)病影響[7]，古麗等[8]研究者證實，在孕婦懷孕早期(一般認(rèn)為懷孕3月)，葉酸的攝入不足以及葉酸相關(guān)拮抗劑的攝入均在一定程度上增加了新生兒唇腭裂的發(fā)生率，但相關(guān)臨床薈萃分析較少，同時進(jìn)一步研究并未發(fā)現(xiàn)新生兒唇腭裂的發(fā)生與葉酸攝入水平存在明顯的劑量依賴性[9]。故此，近三年來部分學(xué)者通過研究提出葉酸對于唇腭裂的發(fā)生影響并不僅僅依靠葉酸攝入水平，更多依靠相關(guān)葉酸代謝途徑，進(jìn)而促進(jìn)部分致畸基因的異常激活，從而增加唇腭裂的發(fā)生率[10]，而C677T多態(tài)性對于先天性唇腭裂的臨床易感性研究較少，本研究重在探討黑龍江省漢族人群中5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂(NSCLP)遺傳易感性的相關(guān)性，進(jìn)而為相關(guān)流行病學(xué)統(tǒng)計以及公共衛(wèi)生領(lǐng)域分析提供依據(jù)。

部分學(xué)者在探討A1298C多態(tài)性與先天性非綜合型唇腭裂的發(fā)生關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，C677正常核型均為677CC，當(dāng)非綜合型唇腭裂易感基因A1298部位核型由A1298AA突變?yōu)?298CC時，部分C677核型突變?yōu)?77TT[11]，提示了C677核型突變可能參與到了非綜合型唇腭裂的發(fā)生機(jī)制中。筆者通過本次研究發(fā)現(xiàn)，野生型C677基因有CC突變?yōu)殡s合型(CT)或者純核型(TT)，進(jìn)一步證實了相關(guān)學(xué)者的提出的假設(shè)[12]，表明C677基因多態(tài)性可能參與到了非綜合型唇腭裂的發(fā)生機(jī)制中，而進(jìn)一步分析可見，單純性唇腭裂以及唇裂伴或者不伴腭裂組T等位基因頻率明顯高于正常對照人群，而相關(guān)基因型分析可見隨著C-T基因突變的發(fā)生，雜合型突變基因型導(dǎo)致新生兒患非綜合型唇腭裂的幾率增加了2～3倍，而當(dāng)C-T突變?yōu)榧兺蛔冃突蛐蜁r，發(fā)生兩種唇腭裂的可能性顯著增加，風(fēng)險可增加7倍左右，提示了C677基因多態(tài)性與非綜合型唇腭裂的發(fā)生關(guān)系， Desai等[13]綜合分析后認(rèn)為，MTHFR基因677C-T或1298A-C突變使控制葉酸代謝的MTHFR蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，MTHFR酶活性顯著下降，而這一代謝途徑對于維持正常血漿5-甲基四氫葉酸和hcy的濃度至關(guān)重要，而hcy與頜面部和神經(jīng)管在胚胎發(fā)育上密切相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)MTHFR基因677C-T突變導(dǎo)致的MTHFR酶活性顯著下降，可進(jìn)一步通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Hey聚集，有可能干擾正常發(fā)育的頜面部組織，影響頜面部突起的正常融合，進(jìn)而導(dǎo)致唇腭裂的發(fā)生。但相關(guān)先天性唇腭裂畸形新生兒產(chǎn)婦的C677基因并無明顯多態(tài)性表現(xiàn)，提示母體相關(guān)位點(diǎn)基因并未在唇腭裂的發(fā)生中發(fā)揮作用，同時提示相關(guān)唇腭裂新生兒C677位點(diǎn)多態(tài)性的獲得性發(fā)生機(jī)制較為少見，多數(shù)病例在胚胎發(fā)育過程中由于環(huán)境或者其他因素進(jìn)而造成相關(guān)位點(diǎn)突變，引起易感基因多態(tài)性表現(xiàn)[11]。

綜上所述，本研究證明了MTHFR基因C677T突變與NSCLP風(fēng)險增高顯著相關(guān)，為葉酸攝入低或葉酸代謝障礙在NSCLP發(fā)生中起重要作用的假說提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。后續(xù)相關(guān)研究應(yīng)更加注重MTHFR基因C677T多態(tài)性與葉酸攝入量之間的交互作用，并對MTHFR酶活性、血漿hcy水平進(jìn)行綜合分析。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱博，王達(dá)，楊博逸，等.中國人群5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂關(guān)系的Meta分析[J].中國全科醫(yī)學(xué),2013,43(38):3825-3827.

[2]喻瓊瓊，石冰.孕婦補(bǔ)充葉酸與唇腭裂畸形發(fā)生的關(guān)系[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志,2014,23(3):368-370.

[3]王蘋，王紅，吳雅慧，等.中國人群葉酸/同型半胱氨酸代謝基因多態(tài)性與非綜合征型唇腭裂關(guān)聯(lián)研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013,16(03):352-358.

[4]Pan X,Wang P,Yin X,etal.Association between maternal MTHFR polymorphisms and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in offspring,A meta-analysis based on 15 case-control studies[J].Int J Fertil Steril,2015,8(4):463-480.

[5]南欣榮，任一雄，李瑞芳，等.葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性與山西地區(qū)非綜合征性唇腭裂的相關(guān)性研究[J].實用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2015,23(1):96-100.

[6]馬麗娟，杜雪飛，董文，等.MAFB 基因多態(tài)性在寧夏回漢人群中與非綜合征型唇腭裂的相關(guān)性研究[J].實用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2015,21(1):57-62.

[7]劉奕杉，凌彬，劉濤，等.探討MTHFR基因多態(tài)性與新疆地區(qū)人群唇腭裂發(fā)病的關(guān)系[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013,34(11):4795-4798.

[8]古麗，王玲，阿地力·莫明.非綜合征性唇腭裂基因突變檢測方法研究[J].中華實用診斷與治療雜志,2014,23(4):313-314.

[9]陳小梅，韓淑芬.葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性在母胎醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用及相關(guān)性研究[J].中國婦幼健康研究,2015,26(1):125-128.

[10]陳丁莉，李守霞，要跟東.非綜合征性唇腭裂候選基因和位點(diǎn)研究進(jìn)展[J].中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志(電子版),2014,22(4):341-345.

[11]de Aguiar PK,Coletta RD,de Oliveira AM,etal.rs1801133C>T polymorphism in MTHFR is a risk factor for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in the Brazilian population[J].Birth Defects Res A Clin Mol Teratol,2015,103(4):292-298.

[12]Abdollahi-Fakhim S,Asghari EM,Varghaei P,etal.Common mutations of the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene in non-syndromic cleft lips and palates children in north-west of iran[J].Iran J Otorhinolaryngol,2015,27(78):7-14.

[13]Desai AL,Dinesh MR,Amarnath BC,etal.Association of transforming growth factor alpha and methylenetetrahydrofolate reductase gene variants with nonsyndromic cleft lip and palate in the indian population[J].Contemp Clin Dent,2014,5(3):329-333.

[收稿2015-09-20修回2015-10-20]

(編輯許四平)

MTHFR gene polymorphism and non syndrome cleft lip and palate correlation study

ANLe，JIAOXiao-Hui,MINa,HAOYan-Ru,SONGHong-Quan.

TheSchoolofDentistryofHarbinMedicalUniversity,Haerbin150000,China

[Abstract]Objective:To investigate 5,10 methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene C677T polymorphism and non syndrome cleft lip and cleft palate (NSCLP) genetic susceptibility correlation.Methods: From June 2014 to May 2015,100 NSCLP patients (case group A) were treated in our hospital,where in cleft palate (CPO group) 23 cases,77 cases of cleft lip with or without cleft palate (CL/P group);at the same time,selected 100 normal children (control group A),100 mothers of NSCLP children (case group B) and 100 normal birth mother (control group B),C677T mutation of MTHFR gene was detected by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism genotyping technique.Results: in case group A,CL/P group C,T allele frequency were 55.84% and 44.16%,CPO group were 54.35% and 45.65%,control group A was 75.00% and 25.00%,CL/P and CPO group T allele frequency was significantly higher group A,the difference was statistically significant (P<0.05);CT genotypes suffering CL/P′s risk was 2.39 times the CC genotype,suffering CPO′s risk was 2.98 times the CC genotype；TT genotypes suffering CL/P′s risk was 6.70 times the CC genotype,suffering CPO′s risk was 7.33 times the CC genotype;there was no significant difference in the allele frequencies and genotype between the case group B and the control group B (P>0.05).Conclusion: C677T mutation of MTHFR gene may be one of the genetic risk factors of NSCLP,but mother MTHFR C677T mutation may unrelated with the offspring NSCLP.

[Key words]MTHFR gene;NSCLP;Relativity;Allele

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.027

作者簡介：安樂(1988年-)，男，主要從事唇腭裂發(fā)生機(jī)制研究。

中圖分類號R782.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0722-04

①哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬口腔醫(yī)院，哈爾濱150000。

②黑龍江省醫(yī)院，哈爾濱150000。

通訊作者及指導(dǎo)教師：焦曉輝(1958年-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事唇腭裂發(fā)生機(jī)制研究。