趙　瑾　劉宏鵬　段相國　張愛君　丁淑琴　徐廣賢

(寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,銀川750004)

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·生物治療·

雷帕霉素對(duì)RAW264.7細(xì)胞6種miRNAs表達(dá)的影響及miR-20a對(duì)ATG16L1的靶向調(diào)控作用①

趙瑾?jiǎng)⒑犍i段相國張愛君丁淑琴徐廣賢

(寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,銀川750004)

[摘要]目的：探討雷帕霉素對(duì)miR-17-92簇中的6種miRNAs表達(dá)的影響，及miR-20a對(duì)ATG16L1基因的靶向調(diào)控作用。方法：利用qRT-PCR檢測(cè)雷帕霉素對(duì)RAW264.7細(xì)胞miR-17-92簇中的miR-20a等6種miRNAs的表達(dá)水平；通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、Western blot，驗(yàn)證miR-20a對(duì)ATG16L1的靶向調(diào)控關(guān)系。結(jié)果：與正常組相比，雷帕霉素組RAW264.7細(xì)胞的miR- 17、miR-18a、miR-20a表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；3-MA組RAW264.7細(xì)胞的miR-20a表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-20a可靶向ATG16L1-3′-UTR，抑制其表達(dá)；Western blot結(jié)果顯示，miR-20a能明顯抑制ATG16L1蛋白的表達(dá)，說明miR-20a可靶向抑制ATG16L1的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞自噬過程。結(jié)論：miR-20可靶向抑制Atg16L1的表達(dá)，參與調(diào)控RAW264.7細(xì)胞自噬過程。

[關(guān)鍵詞]miR-20a;靶向調(diào)控；細(xì)胞自噬

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類進(jìn)化保守的非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其靶向mRNA進(jìn)行降解或抑制其表達(dá)。目前研究顯示microRNAs可以通過調(diào)控一些基因信號(hào)分子(例如生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、前程序性死亡細(xì)胞基因等)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、增殖和死亡的調(diào)控功能[1]。

自噬(Autophagy)是一種生物學(xué)代謝機(jī)制，主要功能就是降解蛋白等物質(zhì)。即細(xì)胞吞噬自身胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器，通過這個(gè)功能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要，也實(shí)現(xiàn)某些細(xì)胞器的更新，從而維持細(xì)胞微環(huán)境和細(xì)胞功能的穩(wěn)定。大量研究發(fā)現(xiàn)，自噬作為一種重要的免疫防御機(jī)制，對(duì)抵抗多種細(xì)胞內(nèi)病原微生物感染起著積極作用[2]。

目前研究已經(jīng)報(bào)道自噬的調(diào)控與許多miRNA相關(guān)。如miR-30a[3]可靶向作用于重要的自噬相關(guān)基因beclin 1，進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬；miR-375在肝癌細(xì)胞中通過靶向ATG7而抑制細(xì)胞自噬[4]，揭示了miRNA與細(xì)胞自噬間存在著一些潛在的關(guān)系。本課題通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-17-92簇中的miR-20a與自噬相關(guān)基因ATG16L1存在著潛在的靶向調(diào)控關(guān)系。進(jìn)一步經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative PCR， qRT-PCR)、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)及Western blot對(duì)靶向關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，將為深入研究 miR-20a、細(xì)胞自噬及后期與結(jié)核分枝桿菌之間的相互作用及其機(jī)制提供理論依據(jù)和研究思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料T4 DNA連接酶、MluⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根(Qiangen)生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific公司；2×SYBR Green I Mix購自Life technology公司；RNAiso for Small RNA購自大連TaKaRa公司；雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購自Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清購自Hyclone公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購自Promega公司；轉(zhuǎn)染試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗ATG16L1抗體購自Abgent公司；miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-19a、miR-19b、miR-92a、ATG16L1及ATG16L1/mut引物序列由上海生工生物有限公司合成;miR-20a mimic/inhibitor引物序列由上海吉瑪(GenePharma)有限公司合成。

1.1.2引物設(shè)計(jì)與合成依據(jù)成熟的miRNA序列來自miRBase數(shù)據(jù)庫，依據(jù)該數(shù)據(jù)庫中的miRNA序列分別設(shè)計(jì)miR-17-92簇中6種miRNA的莖環(huán)引物及其各自特異性上游檢測(cè)引物(表 1、2) ，Real-Time PCR通用下游引物:CTCAACTGGTGTC-GTGGA；以U6作為內(nèi)參并根據(jù)NCBI中U6的成熟序列設(shè)計(jì)U6的特異性引物。內(nèi)參基因U6上游引物：CTCGCTTCGGCAGCACA；U6下游引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT。所有引物及DNA測(cè)序均由上海生工生物有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞以2×106ml-1的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞生長匯合至80%～90% 時(shí)，細(xì)胞分別按以下方法進(jìn)行處理:雷帕霉素處理細(xì)胞2 h、3-甲基腺嘌呤(3-MA)處理細(xì)胞12 h，正常對(duì)照組細(xì)胞不作處理，各組細(xì)胞于37℃、50 ml/L CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2RNA的提取與cDNA合成利用大連TaKaRa公司的RNAiso for SmallRNA試劑分別提取雷帕霉素組、3-MA組及正常對(duì)照組的RNA，并以此RNA為模板，利用miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-19a、miR-19b、miR-92a 的莖環(huán)引物，經(jīng)42℃，60 min；85℃，5 min完成反轉(zhuǎn)錄過程，合成其相應(yīng)的cDNA。

1.2.3miRNA表達(dá)量的檢測(cè)采用熒光定量PCR(qRT- PCR) 檢測(cè)雷帕霉素組、 3-MA組及正常對(duì)照組等各組中上述6種miRNAs的表達(dá)量，同時(shí)檢測(cè)各組U6的表達(dá)量作為內(nèi)參，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，結(jié)果采用相對(duì)定量法，公式:2-△△Ct，其中△△Ct=(待測(cè)樣本Ct-待檢測(cè)樣本U6Ct)-(正常組Ct-正常組U6Ct)，計(jì)算6種miRNA的相對(duì)表達(dá)量，并取三平行復(fù)孔的平均值

表2Real-time PCR上游檢測(cè)引物

Tab.2List of primers used for qRT-PCR

NameSequences(5'-3')miR-17ACACTCCAGCTGGGCAAAGTGCTTACAGTGCAGGmiR-18aACACTCCAGCTGGGTAAGGTGCATCTAGTGCAGAmiR-19aACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCTATGCAAAACmiR-20aACACTCCAGCTGGGTAAAGTGCTTATAGTGCAGGmiR-19bACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCCATGCAAAACmiR-92aACACTCCAGCTGGGTATTGCACTTGTCCCGGCCTG

表1莖環(huán)引物

Tab.1List of primers used for reverse transcription

NameSequences(5'-3')miR-17CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGCmiR-18aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTATCTGCACTAGATGmiR-19aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGTTTTGCATAmiR-20aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGCACTATAAGmiR-19bCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGTTTTGCATGmiR-92aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGGCCGG

1.2.4生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)應(yīng)用PicTar、RNA22、Target Scan、miRanda等生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)站進(jìn)行miR-20a的靶基因的預(yù)測(cè)及甄選。

1.2.5載體構(gòu)建構(gòu)建pMIR-Report-ATG16L1-3′UTR及pMIR-Report-ATG16L1-3′UTR-mut重組質(zhì)粒。

1.2.6miR-20a與自噬相關(guān)基因ATG16L1靶向關(guān)系的驗(yàn)證

1.2.6.1雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析將miR-20a mimic和空白對(duì)照NC分別與pMIR-Report-Atg16L1、pMIR-Report-ATG16L1 mut(突變體)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞中，各組均共轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶(PRL-TK)作為內(nèi)對(duì)照，48 h后根據(jù)雙熒光素酶檢測(cè)試劑說明操作，利用微孔板發(fā)光分析儀檢測(cè)各組中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報(bào)告基因的活性，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算其平均值。

1.2.6.2ATG16L1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-20a mimic、NC和miR-20a inhibitor至RAW264.7細(xì)胞中，構(gòu)建miR-20a過表達(dá)/抑制表達(dá)的細(xì)胞模型，分別提取各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度，并利用Western blot法檢測(cè)各組中ATG16L1蛋白表達(dá)情況。

2結(jié)果

2.2生物信息學(xué)分析及驗(yàn)證miRBase檢索成熟 miR-20a序列，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行miR-20a的靶基因預(yù)測(cè)(圖 2)。成功將ATG16L1-3′UTR及其突變體插入pMIR-Report載體中，構(gòu)建pMIR-Report-ATG16L1-3′ UTR及pMIR-Report-ATG16L1-3′ UTR-mut重組質(zhì)粒，并經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證 (圖2) 。

2.3miR-20a與ATG16L1 靶向關(guān)系的驗(yàn)證

2.3.1miR-20a的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)可知， miR-20a mimic組中的miR-20a表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比，上調(diào)約8.75倍，而 miR-20a inhibitor 組中的miR-20a表達(dá)水平下調(diào)約2倍(圖3)，說明miR-20a mimic 及miR-20a inhibitor 轉(zhuǎn)染成功。

2.3.2雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)分析雙熒光素酶分析與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-20a mimic組明顯抑制ATG16L1的相對(duì)熒光素酶活性，下降約1.8倍 (P<0.05) ；而ATG16L1-mut組相對(duì)熒光素酶活性沒有明顯變化(圖4)。表明miR-20a能靶向作用于ATG16L1-3′UTR的特異位點(diǎn)，抑制其表達(dá)。

圖1　細(xì)胞自噬模型中6種miRNA的相對(duì)表達(dá)水平Fig.1　Results of expression of 6 kinds of miRNA in model of cell autophagyNote: 1.NC;2.Treated by rapamycin(50 ng/ml) for 2 h;3.Treated by 3-MA(10 nmol/L) for 12 h.*.P<0.05.

圖2　miR-20a靶基因預(yù)測(cè)及重組質(zhì)粒pMIR-Report-ATG16L1-3′UTR及其突變體測(cè)序驗(yàn)證Fig.2　Interaction sites of miR-20a with predicted target gene ATG16L1-3′UTR and sequencing results of pMIR-Report-ATG16L1-3′UTR plasmid

圖3　實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-20a相對(duì)表達(dá)水平Fig.3　To detect relative expression level of miR-20a with real-time PCRNote: 1.NC；2.miR-20a mimic；3.miR-20a inhibitor；*.P<0.05.

圖4　雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-20a與ATG16L1靶向抑制作用Fig.4　To varify targeted inhibition between miR-20a and ATG16L1 with luciferase reporter systemNote: 1,3.miR-20a mimic；2,4.NC；*.P<0.05.

圖5　Western blot法檢測(cè)ATG16L1蛋白表達(dá)水平Fig.5　To detect protein expression level of ATG16L1 with Western blot analysis Note: β-actin as an internal reference.1.miR-20a mimic；2.miR-20a inhibitor；3.NC.

2.4Western blot法檢測(cè)ATG16L1蛋白的表達(dá)通過Western blot法檢測(cè)ATG16L1在蛋白水平上的表達(dá)，與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-20a mimic 組能顯著降低ATG16L1的表達(dá)量;而轉(zhuǎn)染 miR-20a inhibitor組ATG16L1蛋白表達(dá)量又明顯升高(P<0.05，圖5) 。

3討論

成熟的microRNA(miRNA) 是一種長約22nt的內(nèi)源性非編碼RNA，能夠通過對(duì)其靶基因靶向降解或抑制其翻譯起到調(diào)控靶基因的表達(dá)作用[5]。miR-17-92是一個(gè)高度保守的miRNA簇，位于人類第13號(hào)染色體上初級(jí)轉(zhuǎn)錄本C13orf25基因的第三個(gè)內(nèi)含子上[6]，編碼6個(gè)成熟的miRNA ：miR-17、miR-18a、miR-19a、 miR-20a、miR-19b和miR-92a。據(jù)已有報(bào)道研究顯示，miR-17-92簇對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長[7,8]、增殖[9,10]、分化[9]、凋亡[10]過程起著重要作用。

最近研究顯示腫瘤、感染、神經(jīng)退行性病變等疾病可能與細(xì)胞自噬異常有關(guān)[11]。已經(jīng)報(bào)道的自噬與許多miRNA相關(guān)，如：miR-130a可以通過作用于靶基因ATG2B和DICER1調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生，對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的存活起到反饋調(diào)節(jié)的作用[12]； miR-199a-5p在不同細(xì)胞中可以抑制或者促進(jìn)DRAM1和Beclin1基因的表達(dá)，使乳腺癌細(xì)胞對(duì)輻射更加敏感，在癌癥生物學(xué)機(jī)制和癌癥治療過程中起到重要作用[13]。因此miRNA可為某些由于自噬異常引起的免疫等相關(guān)疾病的治療提供新的思路。雷帕霉素作為細(xì)胞自噬發(fā)生常用的誘導(dǎo)劑之一，能夠抑制mTOR途徑，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[14]。3-MA可抑制PI3K，是一種常見的自噬抑制劑[15]。

近年來研究顯示，巨噬細(xì)胞的自噬作為固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要組成部分可參與胞內(nèi)感染病原體的清除。在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生能促進(jìn)吞噬體和溶酶體的融合，從而抑制胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌(Mtb)的存活[16,17]。而同時(shí)結(jié)核分枝桿菌分泌的蛋白可抑制吞噬小體與溶酶體的融合，從而使其能在巨噬細(xì)胞內(nèi)長期存活造成潛伏感染[18,19]。

然而miRNA如何調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬，進(jìn)一步影響結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)存活的機(jī)制目前尚不完全明確，因此本課題研究為下一步探究miR-20a在巨噬細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌的免疫調(diào)控作用及其機(jī)制，提供一定的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)，對(duì)結(jié)核病預(yù)防與治療的研究起到推動(dòng)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Chen C.MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J].N Engl J Med,2005,353(17):1768-1771.

[2]Morris S,Swanson M,Lieberman A,etal.Autophagy-mediated dendritic cell activation is essential for innate cytokine production and APC function with respiratory syncytial virus responses[J].J Immunol,2011,187(8):3953-3961.

[3]Zhu H,Wu H,Liu X,etal.Regulation of autophagy by a beclin 1-targeted microRNA,miR-30a,in cancer cells[J].Autophagy,2009,5(6):816-823.

[4]Chang Y,Yan W,He X,etal.miR-375 inhibits autophagy and reduces viability of hepatocellular carcinoma cells under hypoxic conditions[J].Gastroenterology,2012,143(1):177-187.

[5]Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[6]Ota A,Tagawa H,Karnan S,etal.Identification and characterization of a novel gene,C13orf25,as a target for 13q31-q32 amplification in malignant lymphoma[J].Cancer Res,2004,64(9):3087-3095.

[7]Sharifi M,Salehi R,Gheisari Y,etal.Inhibition of microRNA miR-92a induces apoptosis and inhibits cell proliferation in human acute promyelocytic leukemia through modulation of p63 expression[J].Mol Biol Rep,2014,41(5):2799-2808.

[8]Chen YJ,Thang MW,Chan YT,etal.Global assessment of Antrodia cinnamomea-induced microRNA alterations in hepatocarcinoma cells[J].PLoS One,2013,8(12):e82751.

[9]Sandhu S K,Fassan M,Volinia S,etal.B-cell malignancies in microRNA Emu-miR-17～92 transgenic mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(45):18208-18213.

[10]Olive V,Sabio E,Bennett M J,etal.A component of the mir-17-92 polycistronic oncomir promotes oncogene-dependent apoptosis[J].Elife,2013,15(2):e00822.

[11]Mijaljica D,Prescott M,Devenish R J.Autophagy in disease[J].Methods Mol Biol,2010,648:79-92.

[12]Kovaleva V,Mora R,Park Y J,etal.miRNA-130a targets ATG2B and DICER1 to inhibit autophagy and trigger killing of chronic lymphocytic leukemia cells[J].Cancer Res,2012,72(7):1763-1772.

[13]Yi H,Liang B,Jia J,etal.Differential roles of miR-199a-5p in radiation-induced autophagy in breast cancer cells[J].FEBS Lett,2013,587(5):436-443.

[14]張濤,鄭錫銘,周林林等.雷帕霉素對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞10種與細(xì)胞自噬相關(guān)的miRNAs表達(dá)的影響[J].中國免疫學(xué)雜志,2014,30(08):1055-1058，1063.

[15]Wang M,Yu T,Zhu C,etal.Resveratrol triggers protective autophagy through the ceramide/Akt/mTOR pathway in melanoma B16 cells[J].Nutr Cancer,2014,66(3):435-440.

[16]Gutierrez MG,Master SS,Singh SB,etal.Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG and Mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages[J].Cell,2004,119(6):753-766.

[17]Amano A,Nakagawa I,Yoshimori T.Autophagy in innate immunity against intracellular bacteria[J].J Biochem,2006,140(2):161-166.

[18]Condos R,Raju B,Canova A,etal.Recombinant gamma interferon stimulates signal transduction and gene expression in alveolar macrophages in vitro and in tuberculosis patients[J].Infect Immun,2003,71(4):2058-2064.

[19]Thompson C R,Iyer S S,Melrose N,etal.Sphingosine kinase 1 (SK1) is recruited to nascent phagosomes in human macrophages:inhibition of SK1 translocation by Mycobacterium tuberculosis[J].J Immunol,2005,174(6):3551-3561.

[收稿2015-09-10修回2015-09-28]

(編輯倪鵬)

Effects of rapamycin on expression of six kinds miRNAs in RAW264.7 macrophages and research on miR-20a′s targeted regulation of ATG16L1 gene expression

ZHAOJin,LIUHong-Peng,DUANXiang-Guo,ZHANGAi-Jun,DINGShu-Qin,XUGuang-Xian.

InstituteofLaboratoryMedicine,NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China

[Abstract]Objective:To detect the influence of rapamycin on the expression of 6 kind of miRNAs of miR-17-92 cluster in macrophages.To study the relationship of miR-20a and ATG16L1 gene.Methods: The expression of miR-17,miR-18a,miR-20a,miR-19a,miR-19b and miR-92a was detected by Real-Time PCR.The targeting effect of miR-20a on ATG16L1 gene was verified by the dual-luciferase reporter assay system and Western blot.Results: After RAW264.7 cells was treated by rapamycin for 2 h，the expression of miR-17,miR-18a,miR-20a increased (P<0.05);After RAW264.7 cells was treated by 3-MA for 12 h，miR-20a was down regulated (P<0.05).The dual-luciferase reporter assay system and Western blot demonstrated that miR-20a could suppress ATG16L1 expression by targeting the specific 3′-untranslated region (3′ UTR) sequence of ATG16L1 gene．Conclusion: miR-20a can directly inhibit the autophagy-related gene ATG16L1 expression and participate in the regulation of autophagy process.It is negatively regulated at the post-transcriptional level.

[Key words]miR-20a;Target regulation;Cell autophagy

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.019

作者簡介：趙瑾(1990年-) ，女，碩士，主要從事臨床病原微生物與免疫學(xué)方面的研究，E-mail:524198608@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：徐廣賢( 1973年-) ，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師， 主要從事臨床病原微生物與免疫學(xué)方面的研究， E-mail:xuguangxian@nxmu.edu.cn。

中圖分類號(hào)R392.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0687-05

①本文為國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31472168)。