李小林　王博遠　程偉寧　吳　純　李大主　朱　靜　汪俊軍

(武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院心內科，武漢430400)

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HSP60口服耐受誘導調節(jié)T細胞Foxp3去甲基化抑制動脈粥樣硬化①

李小林王博遠②程偉寧吳純②李大主②朱靜汪俊軍

(武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院心內科，武漢430400)

[摘要]目的：探討Foxp3去甲基化在HSP60口服耐受抑制動脈粥樣硬化中的作用。方法：8周齡載脂蛋白E-/-小鼠分別口服重組鼠熱休克蛋白60-PBS溶液和單純 PBS溶液,連續(xù)5天后高脂飼養(yǎng) 12周，監(jiān)測期間兩組脾細胞CD4+CD25+調節(jié)性T細胞內DNA甲基化轉移酶表達，F(xiàn)oxp3啟動子甲基化水平，細胞因子分泌程度，脾細胞中CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞百分比，斑塊面積。結果：與對照組比較,口服熱休克蛋白 60組脾細胞CD4+CD25+調節(jié)性T細胞內DNA甲基化轉移酶表達顯著降低，F(xiàn)oxp3啟動子甲基化水平顯著降低，抑炎因子 IL-10和 TGF-β分泌顯著增加,而促炎因子IFN-γ分泌顯著降低，脾細胞中CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞比例明顯提高，斑塊面積顯著減小。結論：HSP60口服耐受通過誘導調節(jié)T細胞Foxp3基因去甲基化導致調節(jié)T細胞功能增強，分化增加，抑制動脈粥樣硬化。

[關鍵詞]熱休克蛋白60；動脈粥樣硬化；Foxp3；調節(jié)T細胞

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種與免疫炎癥反應密切相關的慢性炎癥性疾病，特異性免疫在AS炎癥反應中起重要作用[1,2]，誘導機體對特異性抗原免疫耐受抑制AS是近年研究的熱點。前期研究表明，口服重組鼠熱休克蛋白60抗原(HSP60)可誘導體內調節(jié)性T細胞(Treg)的分化，抑制系統(tǒng)炎癥反應，進而抑制AS[3-6],但是HSP60口服調控Treg以抑制AS的分子機制尚不清楚。叉頭蛋白Foxp3是迄今所發(fā)現(xiàn)的Treg的最關鍵的和特異性的轉錄因子，決定著Treg的發(fā)育和免疫調節(jié)功能。Foxp3甲基化譜表明，去甲基化是Foxp3的穩(wěn)定表達和具備抑制功能的前提[5-9]。本文探討Foxp3去甲基化在HSP60口服誘導Treg分化抑制AS中的作用。

1材料與方法

1.1動物與試劑8周齡C57BL/6J 載脂蛋白E(apoE)-/-雄性小鼠購自北京維通利華有限公司；重組小鼠HSP60購自Stressgen公司；提DNA試劑盒及PCR試劑盒為TaKaRa Biotec公司產品；DNA甲基化相關檢測盒和DNA甲基化轉移酶1(DNMT1)抗體購自Sigma公司；氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購自Yiyuan Biotechnologies公司；TGF-β、IL-10和IFN-γ ELISA試劑盒購自Phar mingen公司；PE標記抗Foxp3抗體、APC標記抗CD25抗體、FITC標記抗CD4抗體均為美國BD公司產品。

1.2方法

1.2.1小鼠分組和高脂飼養(yǎng)實驗小鼠分2組：HSP60口服耐受組(n=30)：5 μg HSP60溶于500 μl PBS液中灌胃；PBS口服對照組(n=30)：只用500 μl PBS灌胃。連續(xù)處理五天，間隔2天后用含有1%膽固醇，30%脂肪的飼料喂養(yǎng)，于0、2、4、8和12周等時間點處死動物，行后續(xù)實驗。

1.2.2斑塊病理分析10%烏拉坦麻醉，取出心臟和主動脈段，置于 4%甲醛中保存，常規(guī)石蠟包埋，垂直主動脈瓣開口血管切片行HE 染色，計算主動脈瓣切面斑塊面積。

1.2.3脾細胞中CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞百分比檢測取各組小鼠脾細胞，分離淋巴細胞，調細胞濃度到1×109L-1， 加入FITC-anti CD4， APC-anti CD25，室溫避光孵育 30 min， PBS沖洗，離心棄上清液，加固定液，避光反應30 min，將破膜劑加入待測細胞中，室溫避光反應 10 min，離心棄上清。重懸細胞，加入PE標記的Foxp3抗體，吹勻，4℃避光反應 30 min，離心棄上清，加入250 μl流式細胞液重懸細胞，用流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+T細胞占總CD4+T細胞的百分比。

1.2.4混合淋巴細胞反應上清液細胞因子檢測用流式細胞術從同系ApoE-/-鼠分選CD4+CD25-T 細胞作為效應性T細胞(Te)，調整細胞密度為5×104/孔，分別加入從HSP60口服耐受組和PBS口服對照組分選的CD4+CD25+T 細胞(Treg細胞與Te細胞比例設為1∶2)，去除紅細胞的同系ApoE-/-鼠脾細胞作為抗原提呈細胞(APC)，調整密度為 2×104/孔，均加入ox-LDL(終濃度50 μg/ml)，于96 孔培養(yǎng)板中 37℃、 5%CO2孵育。5 d后收集上清液并檢測 IFN-γ、TGF-β 和 IL-10 的濃度(ELISA法)。

1.2.5Foxp3甲基化分析流式細胞術分選各組CD4+CD25+Treg，提取DNA。按DNA甲基化試劑盒說明書操作，行重硫酸鹽處理使DNA所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，PCR擴增Foxp3啟動子區(qū)域目的基因，上游引物序列：5′-TATAAAAACCCCCCCCCACC-3′，下游引物序列：5′-TGGTGAAGTGGATTGATAGAAAAGG-3′，擴增產物為 198 bp，擴增后尿嘧啶轉變成胸腺嘧啶，行基因測序，對PCR產物進行測序并且與原始序列比較，分析Foxp3啟動子區(qū)甲基化水平。

1.2.6DNA甲基化轉移酶(DNMT)測定流式細胞術分選各組CD4+CD25+Treg，提取蛋白。制備 SDS-PAGE 凝膠后上樣電泳，電泳結束后，使用轉移電泳裝置，在 4℃， 400 mA 恒流條件下電轉 120 min，將蛋白轉移到 PVDF 膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉，室溫2 h，TBST洗膜，孵育一抗兔抗鼠DNMT抗體(1∶500稀釋)，兔抗鼠β-actin抗體(1∶1 000稀釋)2 h或4℃過夜。TBST 洗膜3次，每次 10 min。用加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶8 000稀釋)，室溫孵育2 h。TBST 洗膜3次，每次10 min。用Image Lab成像系統(tǒng)檢測并收集圖像。

2結果

2.1各組ApoE-/-小鼠主動脈瓣處粥樣斑塊面積高脂飼養(yǎng)4、8和12 周后,病理學檢查顯示,HSP60口服組主動脈粥樣斑塊面積明顯小于PBS對照組斑塊面積(P<0.05)，高脂飼養(yǎng)0周和2周，兩組主動脈粥樣斑塊面積無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

2.2脾細胞中 CD4+CD25+Foxp3+細胞表達高脂飼養(yǎng)2、4、8和12周后,HSP60口服組CD4+脾細胞中CD25+Foxp3+細胞陽性率明顯高于PBS對照組(P<0.05)。高脂飼養(yǎng)0周，兩組CD4+脾細胞中CD25+Foxp3+細胞陽性率無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

2.3混合淋巴反應體系上清液細胞因子高脂飼養(yǎng)0、2、4、8和12 周后,HSP60口服組混合淋巴反應體系上清液TGF-β和IL-10濃度明顯高于PBS對照組(P<0.05)，IFN-γ濃度明顯低于PBS對照組(P<0.05)。見圖3。

2.4Foxp3甲基化水平高脂飼養(yǎng)0、2、4、8和12 周后,HSP60口服組脾臟CD4+CD25+T細胞Foxp3啟動子區(qū)甲基化水平明顯低于PBS對照組(P<0.05)。見圖4。

圖1　各組主動脈粥樣斑塊面積比較Fig.1　Atherosclerotic lesion in different groupsNote: A.Representative cross section of lesion formation in the aortic valve area stained with Oil-Red-O at 12 weeks after HDF；B.Lesion size in different groups are showed,*.P<0.05,vs Control at the same week.

圖2　各組脾細胞中CD4+CD25+Foxp3+細胞占總CD4+脾細胞百分比的比較Fig.2　Percentage of CD25+Foxp3+ amongst CD4+ T cells from spleen detected by flow cytometryNote: A.Median representative flow cytometry of CD4+CD25+Foxp3+ cells from spleen at 12 weeks after HFD；B.Dates of CD25+Foxp3+/CD4+ cells in differen groups are shown,*.P<0.05,vs Control at the same week.

圖3　混合淋巴反應體系上清液細胞因子濃度Fig.3　Level of cytokines in medium of mixed lymphocytesNote: *.P<0.05,vs Control at the same week.

圖4　各組脾CD4+ CD25+ T細胞Foxp3甲基化水平Fig.4　Foxp3 methylation level of CD4+CD25+ splenic T cellNote: *.P<0.05,vs control at the same week.

圖5　各組脾CD4+ CD25+ T細胞DNMT1表達水平Fig.5　DNMT1 expression in CD4+CD25+ splenic T cellNote: A.Representative bands of DNMT1 expession in CD4+CD25+ splenic T cell at 0 week after HFD.B.Dates of DNMT1 expression are shown,*.P<0.05,vs control at same week.

2.5DNA甲基化轉移酶1(DNMT1)高脂飼養(yǎng)0、2、4、8和12 周后,HSP60口服組脾臟CD4+CD25+T細胞內DNMT1表達明顯低于PBS對照組(P<0.05)。見圖5。

3討論

AS 是動脈血管壁的一種慢性疾病，特異性免疫在AS炎癥反應中起重要作用[1,2,6]。表達HSP60的病原體(肺炎衣原體等)致敏或感染ApoE-/-小鼠，可加速AS發(fā)展[10]。因此粘膜途徑及口服方式誘導機體對AS相關抗原的免疫耐受是AS防治一種極有希望的手段，正成為相關領域的研究熱點。與其他學者研究結果一致，前期研究發(fā)現(xiàn)，給高脂飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠口服HSP60可顯著性抑制小鼠AS斑塊形成。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，口服HSP60可誘導體內調節(jié)性T細胞(Treg)的分化，抑制系統(tǒng)炎癥反應，進而抑制AS[3]。Treg是機體內的專職和功能強大的抑制性T細胞，在機體免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用，其在AS炎癥反應中的調節(jié)作用也受到極大的關注。然而，時至今日，人們對抗原口服誘導Treg分化的機制知之不多。

叉頭蛋白Foxp3是迄今所發(fā)現(xiàn)的Treg最關鍵的和特異性的轉錄因子， Foxp3決定著Treg的發(fā)育和免疫調節(jié)功能。Foxp3表達的缺陷可導致嚴重的自身免疫性疾病的產生，體內轉染Foxp3或誘導其

表達可抑制AS、自身免疫性疾病及抗移植免疫等。近年來，表觀遺傳學研究表明，F(xiàn)oxp3的穩(wěn)定性受環(huán)境因素對DNA的修飾作用的影響，其中包括DNA甲基化，修飾部位位于DNA上的調節(jié)性T細胞特異性去甲基化位點(Treg-specific demethylated region，TSDR)。在DNA甲基轉移酶(DNMT)作用下，DNA被甲基化，直接影響對甲基化敏感的Foxp3的作用，使它們失去結合DNA 的功能從而阻斷轉錄，使Treg得分化和功能受抑制。Treg獨特的FOXP3啟動子的甲基化譜表明，去甲基化是FOXP3的穩(wěn)定表達和具備抑制功能的前提。研究表明，F(xiàn)OXP3甲基化與多種免疫炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有關，最近研究認為FOXP3甲基化與冠心病患者AS病變程度相關，而FOXP3的去甲基化又與自身免疫性疾病治療的良性轉歸有關[5-9]。

本實驗通過監(jiān)測HSP60口服耐受ApoE-/-小鼠的Foxp3甲基化狀態(tài)，Treg分化和功能，以及斑塊水平，探究Foxp3去甲基化在HSP60口服耐受抑制AS中的作用。HSP60口服耐受后小鼠脾細胞CD4+CD25+調節(jié)性T細胞內DNMT表達降低，F(xiàn)oxP3啟動子甲基化水平降低，抑炎因子 IL-10和 TGF-β分泌升高， 而促炎因子IFN-γ分泌減少，脾細胞中CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞增加，高脂飼養(yǎng)12周后斑塊面積明顯低于對照組。表明HSP60口服耐受可以誘導小鼠Treg的Foxp3基因去甲基化，導致Treg功能增強，分化增加，抑制AS。希望此機制的研究結果可以為 AS 的預防提供新的干預靶點。

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[收稿2015-08-19]

(編輯許四平)

Oral tolerance to HSP60 induces regulatory T cell Foxp3 demethylation and inhibits atherosclerosis

LIXiao-Lin,WANGBo-Yuan,CHENGWei-Ning,WUChun,LIDa-Zhu,ZHUJing,WANGJun-Jun.

DepartmentofCardiology，XinzhouDistrictPeople′sHospitalofWuhan,Wuhan430400,China

[Abstract]Objective:To explore the role of regulatory T cell Foxp3 demethylation in the atherosclerosis inhibition induced by oral tolerance to HSP60.Methods: 8 weeks old ApoE-/-mice were randomly divided into two groups that were orally ad ministrated PBS plus HSP60 and only PBS separately for 5 days,and then a high-cholesterol diet was started 5 days after the last treatment for 12 weeks.During this time,the expression of DNA methyltransferase and the level of Foxp3 methylation in CD4+CD25+ regulatory T cells was measured,cytokines in the supernatant were measured,percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the splenocytes was analyzed,pathological analysis of plaque was performed.Results: With those in the PBS control group,in the HSP60 group the express of DNA methyltransferase and the level of Foxp3 methylation in CD4+CD25+ regulatory T cells was obviously decreased,the level of IL-10 and TGF-βwere obviously increased,the level of IFN-γ was obviously decreased,percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the splenocytes was obviously increased,size of atherosclerotic plaques was obviously decreased.Conclusion: Oral tolerance to HSP60 Induces regulatory T cell Foxp3 demethylation,which could increase the function and number of regulatory T cell,to inhibit the formation of atherosclerosis plaque.

[Key words]HSP60;Atherosclerosis;Foxp3;Regulatory T cell

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.006

作者簡介：李小林(1975年-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事冠心病發(fā)病機理及其診斷與治療的研究，E-mail: lxl1268@163.com。

中圖分類號R392.11

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0633-04

①本文為武漢市衛(wèi)計委科研基金資助項目(No.WX14B37)。

②華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院心內科，武漢430022。