董學美，郭文輝，羅維蕓，許世清，蔡寒青*

(1.吉林大學第二醫(yī)院 內分泌科，長春130041；2.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學研究所，北京100029)

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*通訊作者

大鼠視網膜毛細血管鋪片的制作技巧改進

董學美1，郭文輝1，羅維蕓1，許世清2，蔡寒青1*

(1.吉林大學第二醫(yī)院 內分泌科，長春130041；2.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學研究所，北京100029)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見而嚴重的微血管并發(fā)癥之一，發(fā)病率隨著糖尿病病程的延長而增加，是導致糖尿病患者視力下降、甚至失明的主要原因[1]，其微血管結構的改變，臨床大多是通過檢眼鏡或眼底熒光素血管造影觀察得到[2]。為研究糖尿病視網膜病變的發(fā)病機制，近年來通過制備糖尿病大鼠模型及其視網膜微血管消化鋪片，來觀察糖尿病視網膜微血管病變的形態(tài)學[3]及進行糖尿病視網膜病變機制的研究越來越多[4]，但由于制備視網膜鋪片標本在技術操作上存在一定難度，往往難以獲得較大面積的高質量視網膜毛細血管鋪片，故影響到實驗室觀察和計量結果，限制了該實驗方法的廣泛應用。近年來我們在制備大鼠視網膜毛細血管鋪片過程中摸索出一些技巧，介紹如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器pH 值為7.4、0.01 mol/L 的PBS液(美國Amresco公司)；4%多聚甲醛液(美國Sigma公司)；3%胰蛋白酶液(美國Amresco公司)；小牛血清(美國Gibco公司)；Schiff試劑(國產，碧云天公司)；10%偏重亞硫酸鈉液(美國Sigma公司)；Mayer’s蘇木素(國產，碧云天公司)；37℃溫水浴鍋(國產EYELA公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.1.2實驗動物7-8周齡的Wistar大鼠10只，雌雄各半，體重250-300 g，均自北京維通利華實驗動物技術有限公司購買[合格證號：SCXK(京)2006-0009]，并飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所的SPF級動物實驗室中。

1.2方法

1.2.1視網膜的消化分離以1%的戊巴比妥一次性腹腔注射麻醉后，經靜脈放血處死Wistar大鼠，以眼科剪立即摘取眼球，浸泡于4%的多聚甲醛溶液中，置于室溫下固定達72 h。然后以濃度0.01 mol/L，pH 值為7.4的PBS緩沖液浸泡過夜。次日取固定好的眼球，在盛有PBS緩沖液的干凈玻璃平皿中，從角膜緣后0.5 mm處剪開，去除眼前節(jié)和玻璃體，從剩下的眼杯內壁仔細剝離出視網膜，轉浸入5 ml含有3%胰蛋白酶的溶液中，置于37℃的恒溫水浴中震蕩、消化2 h。此時加入2 ml冷的10%小牛血清并置于冰上冷卻以中止消化，將其轉入干凈平皿，用自制的小圓頭玻璃棒輕輕撥動，使視網膜舒展地平鋪并漂浮在水中；再用玻棒從其下方托起，移入另一裝有適量蒸餾水的干凈平皿中。在蒸餾水中反復輕輕撥動震蕩視網膜，直至完全清除神經及其他纖維成分。

1.2.2視網膜的鋪片在一潔凈的載玻片上先滴一滴蒸餾水，再用玻璃棒挑起已消化干凈的視網膜血管網，迅速轉移至載玻片上的水滴中，不斷輕柔轉動玻璃棒，使視網膜血管網自然伸展開并漂浮在水滴上，注意避免重疊，然后置于平臺上待蒸餾水在室溫下自然揮發(fā)干燥。

1.2.3PAS染色將完全干燥后伸展鋪于載玻片上的視網膜血管鋪片再次用蒸餾水輕洗，以滴管滴一滴1%的高碘酸，室溫下氧化5 min，然后反復用蒸餾水清洗5 min，再以Schiff試劑染色15 min。在流水下清洗10 min，再用適量Mayer’s蘇木素液復染細胞核3 min，最后用流水清洗。脫水封片后即可在光鏡下觀察視網膜血管形態(tài)學改變，如需計量，即可在高倍鏡下記數1000個毛細血管細胞，并計算內皮細胞/周細胞(E/P)比值。

2結果

制備良好的視網膜鋪片，當在低倍鏡下觀察時(圖1a)，可見整張視網膜血管網大而清潔，無折疊、破損或卷曲成團。各級小血管分布清晰，毛細血管排列分布自然順暢，結構完整，各毛細血管之間無神經及其他纖維成分的殘留。當在高倍鏡下觀察時(圖1b)，可見毛細血管網絡樣結構完整，分布無扭曲；毛細血管內皮細胞細胞核呈長橢圓形，細胞染色較淡。毛細血管周細胞的細胞核則呈圓形，染色相對較深。

圖1　大鼠視網膜鋪片(PAS染色，1a ×20；1b ×100 )

3討論

1960年Kuwabara和Cogan[5]發(fā)明了視網膜血管鋪片技術，1963年Ashton[6]又對該技術進行了改進。參照一些文獻的介紹[3,5-7]，我們摸索了一些制做高質量大鼠視網膜毛細血管網鋪片的經驗，現總結如下：

3.1視網膜的消化分離多聚甲醛對組織穿透性強，能保持組織抗原性，且引起組織的收縮性小，較適合于光鏡下觀察組織細胞形態(tài)的研究。我們在處死大鼠取眼球后，經多次摸索的組織固定條件為4%多聚甲醛室溫下固定72 h后再分離視網膜的效果最佳。為充分去除視網膜結構中的神經組織又不過度損害微血管結構和形態(tài)，我們采用將視網膜浸于含3%胰酶的溶液于37℃水浴中不斷震蕩進行消化共2 h而非單純靜置消化，使消化分離過程更加充分；當消化結束時則迅速加入冷的小牛血清并迅速轉入冰浴中冷卻中止消化，防止因消化過度而損傷毛細血管網的完整性；之后可以通過反復在蒸餾水中機械漂洗經胰酶消化過的視網膜，幫助充分去除殘存的神經組織和基質成分。

3.2鋪片時需注意的問題實驗操作中動作應輕柔、迅速、準確，并事先做好相應的準備：如從平皿蒸餾水中托出消化好的血管網后，要及時、快速地將其轉移浸入載玻片的蒸餾水水滴中，注意應避免將其在干燥的空氣中晾置時間過長致使視網膜血管網風干而粘附于玻棒上造成破壞；另外，移動視網膜前必須在平皿中順一個方向輕輕轉動玻棒，使視網膜血管網能充分展開漂浮于水中再移動其轉入玻片；轉入玻片的水滴后應再次輕輕轉動玻棒將其再次自然展開鋪在小水滴上，避免干燥后出現折疊的現象。

3.3制備良好的操作工具視網膜經胰酶消化后，神經及纖維組織清除干凈，使之變得十分菲薄稀疏，暴力操作極易造成其破損或粘連，因此需要有合適的工具進行所有操作。我們曾經先后試用過如眼科鑷、自制燒彎的玻璃吸管等工具，均易造成了血管網的破損和粘連，制作效果不盡人意。最終參照項曉人等[7]的方法，自行制備了小圓頭玻璃棒用于剝離和轉移大鼠視網膜，大小適合的玻璃棒光滑的圓面不會造成粘連和血管網的破損，因此大大提高了視網膜鋪片的成功率及質量。

總之，通過反復試驗摸索和技術改進，我實驗室目前能夠成功制備高質量的大鼠視網膜毛細血管鋪片，為進行糖尿病微血管病變的實驗研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Frank RN.Diabetic Retinopathy[J].New England Journal of Medicine,2004,35(1):48.

[2]Gerald Liew,Jie Jin Wang,Paul Mitchell,et al.Retinal Vascular Imaging:A New Tool in Microvascular Disease Research[J].Circ Cardiovasc Imaging，2008，1;156.

[3]潘琳，周水平，郭艷茹，等.糖尿病視網膜微血管形態(tài)學改變的實驗研究[J].中華眼科雜志，2004，40(6):416.

[4]許世清，姜永瑋，王慧，等.糖基化終末產物誘導大鼠視網膜微血管內皮細胞表型和功能改變[J].中華糖尿病雜志，2010，2(5):262.

[5]Kuwabara T,Cogan DG.Studies of retinal vescular patterns.I.Normal architecture[J].Arch Ophthalmol，1960，64:904.

[6]Ashton N.Studies of the retinal capillaries in relation to diabetic and other retinopathies[J].Brit J Ophthal，1963，47:521.

[7]項曉人，王堅，朱荃.視網膜毛細血管鋪片制作技巧.臨床與實驗病理學雜志，2002，18(5)：564.

基金項目:吉林省科技廳基金項目(編號：201215054)

文章編號：1007-4287(2016)05-0710-02

作者簡介：董學美(1990-)，在讀碩士研究生；蔡寒青(1972-)，女，博士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導師，主要從事糖尿病及內分泌代謝疾病的診治。

(收稿日期：2015-09-17)