孫　波，劉嘉婧，劉曉陽，孫亞娟，周慶偉，權(quán)　威，陳加俊*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長春130021；2.吉林省食品藥品認(rèn)證中心；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科)

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*通訊作者

新的腫瘤抑素對C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤體外實驗研究

孫波1，劉嘉婧2，劉曉陽3，孫亞娟3，周慶偉1，權(quán)威3，陳加俊3*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長春130021；2.吉林省食品藥品認(rèn)證中心；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)腫瘤，呈浸潤性生長，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，據(jù)文獻(xiàn)報道，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[1-3]。其傳統(tǒng)的治療原則是術(shù)后先放療后化療，或單獨放療/化療，但都難以提高其臨床療效[4]，治愈率仍較低。近年來，研究者們通過大量的基礎(chǔ)研究正在尋求治療腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新策略。目前國內(nèi)外已研究出的抗腫瘤藥物眾多，但多數(shù)價格昂貴且不良反應(yīng)大，同時也存在耐藥性問題，使其臨床應(yīng)用受到一定限制[5-7]。為此，尋找高效、低毒、價廉的新的治療藥物成為近年來研究的熱點。本實驗旨在研究一種新的腫瘤抑素對C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的影響，并通過檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲及細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)變化，初步探討其抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究新的腫瘤抑素在臨床上治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供了新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑及藥品

1.2主要儀器

(1)倒置顯微鏡 NiKon ECLIPSE 80i (日本尼康公司)；(2)二氧化碳培養(yǎng)箱 (日本 三樣電機(jī)株式會社制造 產(chǎn)品型號：NCO-15AC)；(3) AN YANG 超凈臺 (中國 蘇州安洋科技發(fā)展有限公司 型號：BSC-BOOⅡB2)；(4) Transwell24板由美國Corning Incorporated生產(chǎn)；(5) 酶標(biāo)儀(中國 上海BIO-RAD公司，MODEL550型)；凝膠成像系統(tǒng)(中國 深圳市宇德立生物科技有限公司，170-8170)。

1.3Transwell小室侵襲實驗法檢測細(xì)胞侵襲能力(1) 將Martrigel基質(zhì)膠與DMEM在4冰箱預(yù)冷，將Martrigel基質(zhì)膠與DMEM按1∶7比例充分混勻后加入Traswell小室中，每孔200 μl，置入37℃培養(yǎng)箱20 min，將上層培養(yǎng)基吸出；(2) 取對數(shù)生長期C6腫瘤細(xì)胞消化﹑計數(shù)為5×104，每小室加入100 μl細(xì)胞懸液后，隨機(jī)分為5組，分別為正常對照組，卡莫司汀組，及不同濃度新的腫瘤抑素(1 000 μg/ml﹑1 500 μg/ml﹑2 000 μg/ml)組。(3) 將30%培養(yǎng)液通過孔隙加入下層中，每孔500 μl。置入37℃、5%CO2孵箱，培養(yǎng)48 h；(4) 棄去上下層培養(yǎng)基，Transwell小室上下層各加入10%甲醛500 μl室溫固定20 min,棄去,500 μl PBS洗兩次后，上下層各加400 μl，1%結(jié)晶紫，20 min后棄去結(jié)晶紫。上下層各用PBS洗2次，末次不棄。(5) 顯微鏡下拍照。

1.4Western Blot檢測細(xì)胞周期蛋白-D1的表達(dá)

(1)取對數(shù)生長期C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，0.25%胰酶消化計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞懸液1×106Cells/ml接種六孔板中，1 ml/孔,37℃、5% CO2培養(yǎng)4 h，(2) 實驗分組(見方法2.1)，每組設(shè)3個復(fù)孔，除正常對照組外，其余每孔加不同的藥物均為500 μl，每孔終體積2 ml。置入37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h；(3)冰上裂解提取細(xì)胞總蛋白，采用BSA蛋白定量檢測試劑盒測定所提取蛋白的濃度；(4)取50 μg蛋白上樣量，經(jīng)15%的SDS-PAGE電泳，采用電轉(zhuǎn)印法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；(5)膜在5%脫脂奶粉封閉 1 h，加兔抗鼠Cyclin-D1(1∶300)，4℃搖床封閉過夜；(6)TBST洗滌15 min×3次，加入羊抗兔二抗(1∶3 000)，室溫孵育60 min；(7)TBST洗滌15 min×3次，取等體積ECL顯色A液和B液，加到PVDF膜上，處理1 min后，將膜放入凝膠圖像儀，曝光5 min，特異性條帶的信號采用凝膠圖像分析系統(tǒng)處理。蛋白表達(dá)灰度值=各組條帶的灰度值/對應(yīng)的β—actin條帶的灰度值

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1Transwell小室實驗結(jié)果不同濃度新的腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力具有不同程度的抑制作用。其中新的腫瘤抑素(1 500μg/ml，2 000μg/ml)組及卡莫司汀組與正常對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；卡莫司汀組與新的腫瘤抑素(2 000μg/ml)劑量組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1及圖1)。

表1　　　　新的腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的

#P<0.05，與正常對照組比較;※P>0.05，與卡莫西汀組比較

2.2新的腫瘤抑素對細(xì)胞周期蛋白-D1表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，不同濃度的新的腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期蛋白-D1的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)作用，正常對照組與新的腫瘤抑素各組及卡莫西汀組比較均具有顯著性差異(P<0.05)，同時也顯示，新的腫瘤抑素(2 000 μg/ml)組與卡莫西汀組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明新的腫瘤抑素對細(xì)胞周期蛋白-D1的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)作用 (見表2及圖2)。

圖1　Transwell小室實驗結(jié)果

表2　　　新的腫瘤抑素對細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的

*P<0.05，與正常組比較,ΔP>0.05,與卡莫西汀組比較

圖2　Western Blot檢測結(jié)果

3討論

近年來，惡性腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年攀升的趨勢，在腦腫瘤中以惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率升高最為明顯[8]，約占顱內(nèi)腫瘤的35-60%以上[9]。由于該病的發(fā)病機(jī)理目前仍不清楚，故其治療一直沒有重大突破。目前主要通過手術(shù)治療，并聯(lián)合化療、放療以減少腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，但其治愈率仍較低，對其治療至今尚無突破性進(jìn)展。故對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效治療手段已成為臨床研究的熱點。

據(jù)文獻(xiàn)報道，國內(nèi)外已研究出的抗腫瘤藥物眾多，但多數(shù)價格昂貴且不良反應(yīng)大，同時也存在耐藥性問題，使其臨床應(yīng)用受到一定限制[10-12]。為此，尋找高效、低毒、療效穩(wěn)定的抗腫瘤藥物是目前研究開發(fā)的重點，而多肽藥物恰恰具備了這些優(yōu)點。另有研究報道，增殖和侵襲是惡性腫瘤最為明顯的生物學(xué)特征，也是惡性腫瘤難以治愈的根本原因。如何抑制惡性腫瘤增殖和侵襲對控制惡性腫瘤進(jìn)展具有重要意義[13-15]。

本實驗采用Transwell小室侵襲實驗法檢測細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果顯示，新的腫瘤抑素(1 500 μL/mL)﹑新的腫瘤抑素(2 000 μL/mL)組分別與正常對照組比較均具有顯著性差異(P<0.05)。這表明新的腫瘤抑素對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明顯抑制其侵襲的作用。

多項研究表明，細(xì)胞生長周期為G1→S→G2→M期，在此細(xì)胞周期中，G1→S期、G2→ M期被認(rèn)為是關(guān)鍵點，并且G1→S期對細(xì)胞的增殖存在重要影響。Cyclin-D1作為G1期細(xì)胞周期素，在G1/S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用[16]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞進(jìn)入S期后Cyclin-D1迅速分解，若Cyclin-D1基因激活并持續(xù)高表達(dá)，則導(dǎo)致G1期縮短，提前進(jìn)人S期，繼而導(dǎo)致遺傳基因突變和染色體結(jié)構(gòu)異常的細(xì)胞獲得增殖能力，引發(fā)細(xì)胞增殖失控，最終形成腫瘤[17]。本研究為進(jìn)一步探討新的腫瘤抑素對細(xì)胞周期及細(xì)胞周期蛋白-D1表達(dá)的影響。同時采用Western blot檢測，結(jié)果也證實了不同濃度的新的腫瘤抑素對C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白-D1的表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用，新的腫瘤抑素(1 500 μl/ml)、新的腫瘤抑素(2 000 μl/ml)組及卡莫西汀組與正常對照組比較均具有顯著性差異(P<0.05)，新的腫瘤抑素(2 000 μg/ml)組與卡莫西汀組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>20.05)。結(jié)果證實，新的腫瘤抑素可能通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力。本研究為新的腫瘤抑素治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床應(yīng)用提供了新的實驗依據(jù)。

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C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株：購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

主要試劑：(1) 結(jié)晶紫由天津光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；(2) 新的腫瘤抑素由本研究室設(shè)計，由上海吉爾公司合成，純度為98%；(3)卡莫司汀由天津金耀藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號：1407011)；Rabbit Anti—Cyclin-D1、HRP羊抗兔IgG、Anti-beta-Actin均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)；PageRuler預(yù)染蛋白Ladder由賽黙飛世爾科技(中國)有限公司生產(chǎn)；RIPA裂解液由碧云天生物技術(shù)研究所(中國)生產(chǎn)。

基金項目：吉林省發(fā)展和改革委員會課題項目(JF2012C008_4)

文章編號：1007-4287(2016)05-0707-03

作者簡介：孫波(1965-)，男，副教授，主要從事藥理學(xué)研究;陳加俊，教授，研究方向：神經(jīng)病學(xué)。

(收稿日期：2015-11-19)