陳其勇，王飛，宓捷波，吳若昕（.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300456；.天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津30007）

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QuEChERS- UPLC- MS/MS法測定食品中（Z）-和（E）-毒蟲畏殘留

陳其勇1，王飛1，宓捷波1，吳若昕2
（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300456；2.天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津300072）

摘要：建立了食品中農(nóng)藥（Z）-和（E）-毒蟲畏殘留量的超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定方法；樣品采用QuEChERS法進(jìn)行前處理；以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫及正離子源（ESI）電離方式，采用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀在選擇離子監(jiān)測模式下進(jìn)行快速測定，保留時(shí)間和離子相對豐度比定性、外標(biāo)法定量；方法定量下限為0.02 mg/kg；毒蟲畏（Z）-和（E）-兩種同分異構(gòu)體得到很好的分離。在大米、小麥2種糧谷類樣品，卷心菜、蘋果、洋蔥、柑橘4種蔬果類樣品和豬肉、牛腎2種動(dòng)物源食品中添加不同濃度的毒蟲畏時(shí)，其平均添加回收率在72.7%～105.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10）小于10%。

關(guān)鍵詞：毒蟲畏；QuEChERS法；超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；食品

毒蟲畏（chlorfenvinphos），也叫殺螟威，是一種土壤殺蟲劑，用于土壤防治根蠅、根蛆和地老虎，還可以防治牛、羊體外寄生蟲，以及用于公共衛(wèi)生方面，防治蚊幼蟲。毒蟲畏多數(shù)為（Z）-和（E）-異構(gòu)體的混合物，其中大多數(shù)是（Z）-異構(gòu)體，為琥珀色油狀液體，（Z∶E）異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)比例為8.5∶1。毒蟲畏廣泛適用于水稻、小麥、蔬菜、甘蔗、棉花等，可通過食物鏈進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，且代謝周期長。對動(dòng)物的毒性主要體現(xiàn)在神經(jīng)和胃腸毒性，毒蟲畏可經(jīng)消化道、呼吸道及皮膚黏膜進(jìn)入人體，生產(chǎn)性中毒主要是由于皮膚黏膜及（或）呼吸道吸入而引起，吸收后迅速分布到全身各器官與組織，主要分布于肝、腎、肺，脾等。

為避免毒蟲畏現(xiàn)有及潛在的危害，其使用已經(jīng)受到了限制。許多國家相應(yīng)的制定了毒蟲畏最高殘留限量［1-3］，涉及大多數(shù)水果、蔬菜、谷物、豆科類等農(nóng)產(chǎn)品及部分動(dòng)物源性食品。2006年頒布的日本肯定列表中對毒蟲畏殘留限量提出了比較詳細(xì)的要求，如對大米、大豆、大麥等糧食作物以及卷心菜、大白菜、橙、菠蘿等果蔬類產(chǎn)品中及動(dòng)物源性食品中肉、肝、腎中毒蟲畏殘留限量分別給出了不同的限量要求［4-5］。近幾年來，隨著對食品安全問題關(guān)注程度的日益加深，國內(nèi)外對農(nóng)藥最大殘留限量要求也日益苛刻。我國目前對毒蟲畏在食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)較落后，但此殺蟲劑當(dāng)前在我國的使用率相當(dāng)高，在大豆、大米、甘藍(lán)、胡蘿卜等農(nóng)作物的種植過程中均有使用，在動(dòng)物源性食品中肉、肝、腎等也有檢出。從國際限量標(biāo)準(zhǔn)及我國的使用情況出發(fā)，開展食品中毒蟲畏的檢測研究是十分必要的［6-8］。

本研究以毒蟲畏為研究對象，建立了QuEChERSUPLC-MS/MS測定食品中毒蟲畏殘留量的方法，提高了檢測靈敏度和定性、定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。該標(biāo)準(zhǔn)適用范圍廣，適用性強(qiáng)，最低定量限能夠滿足當(dāng)前國際貿(mào)易和食品安全管理要求，能夠?yàn)槲覈称愤M(jìn)出口提供可靠的檢測服務(wù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Xevo TQMS超高壓液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子源（ESI源）：美國Waters公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置、T-25型組織勻漿機(jī)、VORTEX 1渦旋混合器：德國IKA公司。

提取溶液為含1%冰乙酸的乙腈溶液，其中乙腈、冰乙酸均為色譜純。無水硫酸鎂（購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）經(jīng)650℃灼燒4 h，保存在干燥器中。N-丙基乙二胺（PSA）吸附劑（美國Agilent公司）：40 μm～100 μm；十八烷基硅烷（C18）吸附劑（美國Agilent公司）：40 μm～100 μm。

毒蟲畏標(biāo)準(zhǔn)品：購于Dr.Ehrenstorfer公司，純度大于95.5%，含有Z-異構(gòu)體和E-異構(gòu)體?；瘜W(xué)分子式C12H14Cl3O4P，CAS編號（Z+E）-異構(gòu)體：470-90-6；（Z）-異構(gòu)體：18708-87-7；（E）-異構(gòu)體：18708-86-6。準(zhǔn)確稱取適量毒蟲畏標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.1 mg，經(jīng)乙腈溶解、稀釋并定容至10 mL，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。此溶液在0℃～4℃條件下避光可儲(chǔ)存6個(gè)月。根據(jù)需要再用乙腈稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2方法

1.2.1樣品的提取

對于糧谷樣品，準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入8 mL水，振搖2 min，靜置10 min。加入4 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，20 mL提取溶劑（含1%冰乙酸的乙腈溶液，下同），劇烈振蕩2 min，5000 r/min離心5min，20 mL提取溶劑重復(fù)提取一次，將上清液合并至150 mL濃縮瓶中，40℃以下濃縮除去溶劑。用2 mL乙腈溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

對于蔬果及動(dòng)物源食品，準(zhǔn)確稱取10 g（精確至0.01 g）試樣（動(dòng)物源食品為5 g）于50 mL螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入20 mL提取溶劑后均質(zhì)，再加入5 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，劇烈振蕩2 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至15 mL螺旋蓋聚丙烯離心管，待凈化。

1.2.2樣品的凈化

將樣品提取液轉(zhuǎn)移到事先裝有300 mg無水硫酸鎂，100 mg PSA填料（蔬果樣品改為300 mg）和100 mg C18填料的15 mL螺旋蓋聚丙烯離心管中；在渦旋混合器上混合1 min，5 000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

1.2.3超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱，2.1 mm× 100 mm，1.7 μm（Waters公司，美國）；柱溫：25℃；流動(dòng)相：甲醇+ 0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序見表1；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.2 mL/min。

表1　超高壓液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elute program of UPLC-MS/MS

Xevo TQ質(zhì)譜，離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式MRM；毛細(xì)管電壓：3.12 kV；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流速：800 L/Hr；錐孔反吹氣流速：50 L/Hr；待測農(nóng)藥定性、定量離子對錐孔電壓和碰撞電壓見表2。

表2　選擇離子與保留時(shí)間Table 2 Selected ions and retention time

2　結(jié)果與討論

2.1色譜條件的選擇

由于毒蟲畏的自身性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測均有報(bào)道［3-6］。此后隨著檢測技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，多殘留檢測的農(nóng)藥種類和數(shù)目也逐漸增多。本實(shí)驗(yàn)室將添加相同濃度毒蟲畏標(biāo)準(zhǔn)溶液的大米基質(zhì)經(jīng)過QuEChERS方法前處理后分別進(jìn)Thermo Fisher氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和Waters超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，對比結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，后者的回收率和儀器靈敏度均高于前者，這可能是由于氣質(zhì)聯(lián)機(jī)法要求前處理過程必須將乙酸、乙腈的溶劑經(jīng)氮吹揮發(fā)，并用正己烷重新定容后再進(jìn)樣的過程中的損失。因此，最終本方法應(yīng)用更高效的QuEChERS方法結(jié)合超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定。

配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的儀器條件進(jìn)行分析，并對待測化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，選擇各化合物的母離子，然后比較各母離子經(jīng)不同能量碰撞時(shí)得到的子離子掃描質(zhì)譜圖，確定每個(gè)化合物的母離子、子離子以及碰撞能量，得到優(yōu)化的質(zhì)譜條件。毒蟲畏標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖見圖1。

圖1　毒蟲畏標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram for chlorfenvinphos standard solution

2.2提取劑凈化方法的選擇

毒蟲畏屬于脂溶性化學(xué)物質(zhì)，易溶于有機(jī)溶劑。目前農(nóng)產(chǎn)品中毒蟲畏的凈化方法主要為凝膠色譜凈化法和固相萃取柱凈化法，經(jīng)過比較，同時(shí)考慮到樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，以及樣品前處理快速、簡單的方法需求，本研究最終采用美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中心的Anastassiades M等開發(fā)的QuEChERS（Quick，Easy，Cheep，Effective，Rugged，Safe）法作為凈化方法。

QuEChERS法針對果蔬類樣品比較成熟，對于含水量較高的果蔬類樣品，乙酸酸化乙腈溶液，在一定程度上降低了提取溶劑的極性，降低了含水基質(zhì)提取液中的含水量，從而降低了后續(xù)的除水壓力，同時(shí)加入少量無水硫酸鎂，在吸水過程中也產(chǎn)熱，萃取液溫度達(dá)45℃左右，促進(jìn)了農(nóng)藥的萃取。

對于含水量較低的糧谷類樣品，應(yīng)先提高含水量，使其達(dá)到75%以上，并相應(yīng)調(diào)整吸附劑和除水劑用量。此外，糧谷類樣品中，毒蟲畏易與脂類物質(zhì)結(jié)合，提取溶劑需滲入組織內(nèi)部，正己烷飽和的乙睛、丙酮和乙酸乙酯均能對此類農(nóng)藥充分提取，但丙酮和正己烷飽和的乙睛提取的共萃物中油脂含量較高，不利于后續(xù)凈化過程，因此，我們最終采用了酸化乙腈溶液作為糧谷類樣品的提取溶劑。

乙二胺-N-丙級硅烷（PSA）吸附劑能夠清除許多極性干擾成分，如來自樣品共萃取物的脂肪酸、親脂性色素和糖類等，而對農(nóng)藥殘留物無吸附作用；十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（GCB）去除維生素、色素、甾醇的能力較好，然而石墨化炭黑具有很強(qiáng)的吸附性，使平面型農(nóng)藥（極性芳香族化合物）不易被洗脫。經(jīng)比較研究發(fā)現(xiàn)采用PSA和C18混合作為吸附劑能夠達(dá)到良好的凈化效果。

2.3線性范圍與定量下限

取濃度不同的毒蟲畏標(biāo)準(zhǔn)溶液做樣品空白添加試驗(yàn)，添加濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1 mg/kg，按照本方法所確定的前處理?xiàng)l件和一起條件進(jìn)行操作，繪制工作曲線，其（Z）與（E）異構(gòu)體的線性方程分別為Y=64 498 426.09X+44 828.26和Y=8 840 234.64X-11 089.07，相關(guān)系數(shù)分別為0.998 9 和0.999 9。根據(jù)信號10倍于噪音時(shí)的樣品添加濃度大小，計(jì)算出方法的定量下限為0.02 mg/kg。

2.4方法的回收率與精密度

分別用大米、小麥、洋蔥、卷心菜、柑橘、蘋果、豬肉、牛腎樣品添加3個(gè)水平的毒蟲畏，進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)（n=10），結(jié)果見表3。

表3　食品中空白樣品添加回收率表Table 3 The corresponding recoveries of fortifying concentrations in food

續(xù)表3　食品中空白樣品添加回收率表Continue table 3 The corresponding recoveries of fortifying concentrations in food

3　結(jié)論

通過對食品中毒蟲畏（Z）-和（E）-異構(gòu)體的提取、凈化、測定的方法研究，建立了可靠、靈敏、準(zhǔn)確、快速的超高壓液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中毒蟲畏的殘留量方法，方法定量限達(dá)到0.02 mg/kg，滿足目前日本、歐盟等國際上對毒蟲畏的殘留分析要求。

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Determination of（Z）- and（E）-Chlorfenvinphos in Food by QuEChERS and UPLC-MS/MS

CHEN Qi-yong1，WANG Fei1，MI Jie-bo1，WU Ruo-xin2
（1. Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300456，China；2. School of Material Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Abstract：A UPLC-MS/MS method for the determination of（Z）- and（E）- chlorfenvinphos in food was established. Chlorfenvinphos in the targeted samples was extracted and cleaned up using QuEChERS. The mobile phase was ultrapure water with 0.1%formic acid in it. Rapid analysis were carried out by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry under electrospray ionization（ESI）and operated in positive mode with gradient elute，qualitative analysis by the retention times and relative intensities of selected ions and quantitation by external standard. Determination limits of this method were 0.02 mg/kg. The mean recoveries ranged from 72.7%-105.2%of fortified samples of 2 grain cereals，which were rice and wheat，and 4 vegetables and fruits，which were cabbage，apple，onion and orange，and 2 animal-derived food，that were pork and beef kidney，with RSD（n=10）less than10%.

Key words：chlorfenvinphos；QuEChERS；UPLC/MS/MS；food

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.035

基金項(xiàng)目：天津檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（TK076-2013）；國家認(rèn)監(jiān)委計(jì)劃項(xiàng)目（2012B313r）

作者簡介：陳其勇（1978—），男（漢），高級工程師，碩士，主要從事農(nóng)獸藥及食品添加劑多殘留檢測技術(shù)研究。

收稿日期：2015-03-03