戴希希

采用HPLC法同時(shí)測定宮瘤清顆粒中大黃素、大黃酚的含量

戴希希

目的 采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定宮瘤清顆粒中大黃素、大黃酚的含量。方法 采用色譜柱為Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm），以甲醇-水(75∶25)為流動相，流速1.0mL/min，檢測波長為286nm，進(jìn)樣量20μL,樣品用甲醇加熱回流提取后，提取液蒸干，殘?jiān)欲}酸溶液(1︰10)溶解后加熱回流，再用乙醚提取，提取液濃縮至干，殘?jiān)蛹状既芙夂笞鳛楣┰嚻啡芤?。結(jié)果 大黃素的量在2.40～19.22μg/mL范圍內(nèi)（r=0.9996），大黃酚的量在5.48～43.80μg/mL范圍內(nèi)（r=0.9992）峰面積積分值與含量呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為98.4%、98.1%。結(jié)論該方法精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，靈敏度高，可用于宮瘤清顆粒中大黃素、大黃酚含量的同時(shí)測定。

宮瘤清顆粒；高效液相色譜法；大黃素；大黃酚；含量測定

江西山高制藥有限公司生產(chǎn)的宮瘤清顆粒為全國獨(dú)家品種，主要組成藥材為熟大黃、桃仁、蒲黃、枳實(shí)、牡蠣、地黃、白芍、甘草等11味中藥[1-4]，該藥具有活血逐瘀、消癥破積、養(yǎng)血清熱等功效，該藥現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ06132008。該藥中熟大黃具有清濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、解毒等作用。本實(shí)驗(yàn)對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提高，采用HPLC法測定該藥處方中熟大黃的有效化學(xué)成分——大黃素和大黃酚的含量，建立HPLC法測定宮瘤清顆粒中所含大黃素和大黃酚含量的同時(shí)測定方法。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 美國waters2695e HPLC儀（2489uv檢測器）；電子天平（1/10萬，德國賽多利斯BP-211D）。

1.2 藥品與試劑 大黃素對照品（批號：110756；來源：中檢院），大黃酚對照品（批號：110796-201118；來源：中檢院，含量99.5%）；宮瘤清顆粒（江西山高制藥有限公司，批號：20131107、20140204、20140402、20140405、20140704）；甲醇為色譜純，AR級乙醚及鹽酸。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)論

2.1 高效液相色譜系統(tǒng)條件 色譜柱：瑞典(Akzo Nobel) Kromasil C18液相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇︰水(75︰25)；流速為1.0mL/min；檢測波長為286.0nm；進(jìn)樣量20μL[1]。

2.2 對照品溶液的制備方法 精密稱取大黃素對照品約10mg及大黃酚對照品約20mg，置同一100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后，用移液管精密量取10mL置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得[5-6]。

2.3 供試品溶液的制備方法 取10袋宮瘤清顆粒，精密稱定內(nèi)容物后，研勻，精密稱定細(xì)粉（約2g),置錐形瓶中，加甲醇30mL，置水浴上加熱回流30min，放冷，濾入50mL量瓶中，用甲醇20mL分次洗滌殘?jiān)盀V器，洗液并入同一量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20mL，蒸干，殘?jiān)欲}酸溶液(1︰10)10mL溶解，置水浴上加熱回流20min，立即冷卻，用乙醚振搖提取4次(20mL 2次、10mL 2次)，合并提取液，濃縮至干，殘?jiān)蛹状汲浞秩芙猓瑩u勻后移至10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用定量濾紙過濾，取續(xù)濾液用微孔濾膜過濾[1]。

2.4 干擾試驗(yàn) 采用宮瘤清顆粒處方（剔除熟大黃），依法制備陰性對照樣品，采用“2.3”方法制備陰性對照溶液。結(jié)果陰性對照溶液（色譜圖中10～12min處)在與供試品溶液中大黃素峰與大黃酚峰（2峰分離度大于2)相同的保留時(shí)間處無色譜峰，供試品溶液中大黃素峰及大黃酚峰保留時(shí)間均在10min之后，且與其他成分分離好，表明在此條件下，處分中其他藥材的成分對該測定無干擾。色譜圖見圖1～圖3。

圖1 對照品色譜圖

圖2 陰性對照色譜圖

圖3 樣品色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取大黃素對照品約25mg及大黃酚對照品約50mg，置同一100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后，用移液管精密量取10mL置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每毫升約含大黃素25μg、大黃酚50μg的混合溶液，分別量取此溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，依照色譜條件測定，繪制工作曲線，得回歸方程：

大黃素為Y=33802X+3244.8，r=0.9996；大黃酚為Y=29873X-3143.2，r=0.9992

表明大黃素在2.40～19.22μg/mL之間，大黃酚在5.48～43.80μg/mL之間，有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 將同一對照品溶液，進(jìn)樣6次，測定大黃素及大黃酚的峰面積，RSD分別為0.21%、0.30%，表明該方法精密度符合藥典要求。

2.7 耐用性試驗(yàn) 將同一供試品溶液，依次在0～12h內(nèi)（常溫下每隔2h進(jìn)樣1次）測定大黃素的峰面積及大黃酚的峰面積。結(jié)果測得平均峰面積分別為662138、920157；RSD分別為0.26%、0.29%，表明12h內(nèi)供試品中大黃素及大黃酚基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號供試品（批號：20140405），按“2.3”方法進(jìn)行含量測定，大黃素、大黃酚的平均含量分別為0.96、1.51mg/袋，RSD為1.6%（n=6）。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知大黃素、大黃酚含量的供試品（批號：20140405）約1.0g，共5份，分別精密加入10mL 0.02402mg/mL的大黃素對照品溶液及10mL 0.03285mg/ mL的大黃酚對照品溶液，按“2.1”方法操作，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1、表2。

表1 回收率測定結(jié)果（大黃素）

表2 回收率測定結(jié)果（大黃酚）

2.10 樣品含量測定 取5份不同批號的供試品，按“2.3”方法操作，結(jié)果見表3、表4。

表3 大黃素測定結(jié)果

表4 大黃酚測定結(jié)果

3 討論

3.1 該藥的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ06132008【含量測定】中有大黃素的含量測定方法，但未同時(shí)對大黃酚進(jìn)行測定，此2種化學(xué)成分雖較為接近，但能在液相色譜同一色譜條件中有效地分開[7-8]。

試驗(yàn)表明，在該色譜條件下，此2種化學(xué)成分分離度較好，符號藥典要求。

3.2 本試驗(yàn)前處理較為復(fù)雜，曾摸索了各種選擇試驗(yàn)以期簡化，但提取此2種化學(xué)成分均不夠完全，故最后確定取樣2g，加熱回流提取，以甲醇-水(75︰25)為流動相為最佳方案。

本試驗(yàn)方法操作簡便、準(zhǔn)確，具有良好的專屬性、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性，認(rèn)為可用于宮瘤清顆粒質(zhì)量控制。

[1] 國家藥典委員編.中國藥典(二部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:963.

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ06132008.

[3] 王鼎峰,胡冰.HPLC法測定宮瘤清片中苦杏仁苷、黃芩苷的含量[J].海峽藥學(xué),2014,26(5):40-43.

[4] 許乾麗,茅向軍,宋曉寧,等.HPLC法同時(shí)測定六味安消膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量[J].藥物分析雜志,2010,30(10):1841-1844.

[5] 畢云生,范云飛,王英萍,等.HPLC法同時(shí)測定消氮顆粒中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚五種成分的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(4):324-326.

[6] 方既明,章懷奮.高效液相色譜法同時(shí)測定麻仁丸中大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的含量[J].中南藥學(xué), 2011,9(5):342-345.

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.6.101

江西 344000 撫州市食品藥品檢驗(yàn)所 （戴希希）