葉筱穎

急性白血病患者P-糖蛋白表達(dá)及其測量的臨床意義

葉筱穎

目的 探討測定急性白血病患者P-糖蛋白表達(dá)量的臨床意義。方法 對120例急性髓系白血病以及急性淋巴細(xì)胞白血病患者，按照患者治療情況分為初始治療組、治愈組、以及復(fù)發(fā)組，各40例，采用免疫組織化學(xué)染色法測定患者血液細(xì)胞中P-糖蛋白表達(dá)量。結(jié)果 120例患者中有46例患者P-糖蛋白表達(dá)陽性，陽性率為38.33%。其中初始組、治愈組、復(fù)發(fā)組患者中陽性表達(dá)P-糖蛋白表達(dá)陽性率為分別為27.5%，20.0%，67.5%，復(fù)發(fā)組與初始治療組以及治愈組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0018、P=0.00032），初始治療組與治愈組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.72）；P-糖蛋白表達(dá)陽性患者治愈率為17.4%，陰性治愈率為43.2%，可見P-糖蛋白表達(dá)陽性治愈率遠(yuǎn)低于陰性治愈率（P=0.021）。結(jié)論 P-糖蛋白在急性白血病復(fù)發(fā)難治組患者中表達(dá)陽性率顯著高于治愈組或者初始治療組，且表達(dá)陰性患者治愈率顯著高于陰性組，表明P-糖蛋白的測定可作為臨床治療急性白血病的治療進(jìn)程指標(biāo)，對臨床指導(dǎo)具有重要意義。

急性髓系白血病；急性淋巴細(xì)胞白血?。籔-糖蛋白；多藥耐藥性

急性白血病是人造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，在發(fā)病時骨髓中的原始細(xì)胞或者幼稚細(xì)胞會大量的惡性增殖從而抑制骨髓正常造血功能[1]。患者多表現(xiàn)為貧血、感染、出血或者浸潤征象。該疾病發(fā)病急，如若不及時治療，患者平均生存期將不超過3個月，有病情急者將在診斷后數(shù)天即死亡。對于急性白血病的治療，目前主要通過支持治療如多休息、防止感染、控制貧血，化療治療甚至骨髓抑制治療?；熤委熓悄壳皝碚f最為可行、也較為有效的方法。但是，如同其他腫瘤細(xì)胞，出現(xiàn)腫瘤多藥耐藥性也是其較為出現(xiàn)的治療障礙之一[2]。多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對某些腫瘤藥物敏感性降低，產(chǎn)生藥物耐受，從而降低治療效果，甚至出現(xiàn)治療效果復(fù)發(fā)。化療產(chǎn)生多藥耐藥性是因為腫瘤細(xì)胞或者惡性增殖的造血干細(xì)胞因機(jī)體許多機(jī)制被激活使得多藥耐藥基因編碼多藥耐藥蛋白，其中P-糖蛋白是其最主要的的種類。本研究將近兩年半江西省上饒市人民醫(yī)院接收治療的急性白血病患者，測定不同治療時期患者P-糖蛋白表達(dá)的量，為臨床治療急性白血病提供臨床依據(jù)，研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究所有患者均來自本院血液科所收治的急性白血病患者標(biāo)本120例，其中包括男64例、女56例，年齡11.6～67.8歲，平均（43.2±5.8）歲。包括急性髓性白血病（AML）患者62例，急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）患者58例。按照急性白血病FAB分型包括：M1期患者26例、M2期患者32例、M3期患者48例、M4期患者14例。所有患者均已根據(jù)臨床癥狀、患者體征、骨髓細(xì)胞學(xué)以及血象、組織化學(xué)檢查等方式確診為相應(yīng)類型白血病，并經(jīng)過免疫學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)的各項有關(guān)急性白血病檢查指標(biāo)所確診。按照患者治療分期分為：初始治療組、治愈組患者、復(fù)發(fā)難治組患者,各40例。3組患者在年齡、性別、疾病分型、治療分期等方面均差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 患者化療方案 對于初始治療組患者急性髓系白血病患者采用阿糖胞苷與高三尖杉酯堿或者阿糖胞苷與柔紅霉素化療方案；對于急性淋巴細(xì)胞白血病患者采用柔紅霉素+長春堿+小劑量的阿糖胞苷或者柔紅霉素+長春堿+潑尼松+左旋門冬酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療[3]。復(fù)發(fā)治療組急性髓系白血病患者采取大劑量去甲基柔紅霉素+阿糖胞苷或者阿糖胞苷+氟達(dá)拉濱+粒細(xì)胞集落刺激因子+阿糖胞苷治療，急性淋巴細(xì)胞白血病患者采用新長春堿+地塞米松+阿霉素化療治療。

1.2.2 P-糖蛋白測定方法 首先分離單個核細(xì)胞：取外周血5～10mL或者骨髓0.5～1.0mL，取肝素抗凝，加磷酸鹽緩沖鹽（PBS）等體積給予稀釋，再采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行梯度離心（相對密度為1.077，2000r/min離心20min給予分離單個細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞圖片，將圖片于-40℃進(jìn)行保存然后進(jìn)行P-糖蛋白檢測。再次進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，采用SAP法，把細(xì)胞圖片用4℃的丙酮給予固定，再用BSA牛血清白蛋白封閉。再采用鼠抗P-糖蛋白單克隆抗體（購自Pharmingen，USA）先稀釋40～60倍之后滴于細(xì)胞涂片上，30μL每個標(biāo)本，4℃孵育過夜。第2天在室溫下用PBS將細(xì)胞涂片洗凈，再給局免疫組換檢測試劑盒（購自福州邁新公司）說明書滴加羊抗鼠二抗，孵育30min，洗凈二抗，滴加顯色復(fù)合物，30min再洗凈SAP復(fù)合物，再加AP-Red給予顯色，以水終止反應(yīng)，再用蘇木素給予復(fù)染，封片后計數(shù)陽性細(xì)胞。陽性細(xì)胞采用P-糖蛋白過表達(dá)的白血病耐藥細(xì)胞組K562作為陽性對照。再以小鼠單克隆抗體進(jìn)行一抗同步染色的K562作為陰性對照。在顯微光鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計數(shù)5000個，陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到10%以上為P-糖蛋白陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件，計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)和例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間P-糖蛋白表達(dá)量比較 所有120例患者中有46例患者P-糖蛋白表達(dá)陽性，陽性率為38.33%。其中初始組、治愈組、復(fù)發(fā)組患者中陽性表達(dá)P-糖蛋白例數(shù)分別為11例、8例、27例。復(fù)發(fā)組患者P-糖蛋白表達(dá)率遠(yuǎn)顯著高于初始組以及治愈組（P=0.0018、P=0.00032），初始組患者與治愈組患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.72）。其中急性髓性白血病患者以及急性淋巴細(xì)胞白血病患者陽性表達(dá)例數(shù)分別為22例以及24例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.48）。見表1。

表1 3組患者P-糖蛋白檢測結(jié)果比較[%（n）]

2.2 P-糖蛋白陽性率與誘導(dǎo)化療治愈率之間的關(guān)系 研究結(jié)果顯示：120例患者中P-糖蛋白表達(dá)陽性患者共46例，其中8例患者得以治愈，P-糖蛋白表達(dá)陽性患者治愈率為17.4%。表達(dá)陰性患者74例，治愈患者達(dá)到32例，治愈率為43.2%，可見P-糖蛋白表達(dá)陽性治愈率遠(yuǎn)高于陰性治愈率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.021）。

3 討論

急性白血病患者主要因為電離輻射、化學(xué)因素、病毒感染、遺傳因素等原因所致。臨床主要表現(xiàn)為貧血、出血、發(fā)熱、浸潤發(fā)生蛋白尿、血尿等。該疾病發(fā)病急，一旦發(fā)病，可在3個月之內(nèi)死亡。因而臨床對于該疾病檢查及診斷極為重要，如進(jìn)行血常規(guī)、血型以及出凝血時間、骨髓象染色檢查或者胸部X線檢查、心電圖、心動圖檢查或者尿常規(guī)、糞便常規(guī)進(jìn)行檢查診斷。以便為及時治療提供時間機(jī)遇給予及時治療[4]。

目前，臨床對于該疾病治療多給予支持治療、化療治療、骨髓移植治療。支持治療主要從感染防治、糾正貧血、控制出血等方面著手。但效果較緩慢，對于急性白血病治療及時性差[5]。骨髓移植主要通過同種基因骨髓移植、一種基因移植治療以及患者自體骨髓移植，但是條件苛刻，難以實現(xiàn)。因而，化療治療成為對急性白血病治療的主要方式。

但是，化療治療時血液細(xì)胞極容易產(chǎn)生多藥耐藥性。是指細(xì)胞對藥物的敏感性降低，治療效果變差，耐藥性增高[6]。主要是因為細(xì)胞產(chǎn)生解除藥物火星的分子發(fā)生變異或者其過度表達(dá)。這主要是因為激活多藥耐藥基因，從而表達(dá)外排化療藥物的蛋白，比如P-糖蛋白所致[7]。用化療方式治療急性白血病患者，其中15%～30%的患者均會產(chǎn)生化療治療多藥耐藥性。由于耐藥性的存在，化療治療效果往往不理想。本研究通過檢測不同治療時期的急性白血病患者包括治療初始是其、治愈患者以及復(fù)發(fā)難治患者進(jìn)行P-糖蛋白表達(dá)。研究結(jié)果顯示，120例患者中有46例患者P-糖蛋白表達(dá)陽性，陽性率為38.33%。其中初始組、治愈組、復(fù)發(fā)組患者中陽性表達(dá)P-糖蛋白表達(dá)陽性率為分別為27.5%，20.0%，67.5%，復(fù)發(fā)組與初始治療組以及治愈組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.0018、P=0.00032），初始治療組與治愈組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.72）；P-糖蛋白表達(dá)陽性患者治愈率為17.4%，陰性治愈率為43.2%，可見P-糖蛋白表達(dá)陽性治愈率遠(yuǎn)高于陰性治愈率（P=0.021）。表明，復(fù)發(fā)難治患者P-糖蛋白表達(dá)高，是因為產(chǎn)生耐藥性，激活耐藥基因從而外排P-糖蛋白所致?；颊弋a(chǎn)生多藥耐藥性與P-糖蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)。

綜上所述，P-糖蛋白表達(dá)量與急性白血病患者產(chǎn)生多藥耐藥性具有顯著相關(guān)性，對于急性白血病患者治療，檢測P-糖蛋白對于預(yù)測患者是否產(chǎn)生耐藥具有一定的依據(jù)，對疾病的治療具有臨床指導(dǎo)意義。

[1] 楊建忠，李碧玲，吳立德，等.急性白血病患者P-糖蛋白與bcl-2的表達(dá)及臨床意義[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2010，26（8）：1126-1128.

[2] Larry D.Cripe,Hajime Uno,Elisabeth M.Paietta,et al.Zosuquidar,a novel modulator of P-glycoprotein,does not improve the outcome of older patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia:a randomized,placebo-controlled trial of the Eastern Cooperative Oncology Group 3999[J].Blood,2010,116(20):4077-4085.

[3] 莫武寧，李山，賴永榕，等.急性白血病P-糖蛋白表達(dá)的臨床意義[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，22(1):68-69.

[4] 高峰，何娟，李艷，等.急性白血病患者P-糖蛋白的表達(dá)及功能分析[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，34（5）：462-465.

[5] Pradeep Singh Chauhan,Bharat Bhushan,LC Singh,et al.Expression of genes related to multiple drug resistance and apoptosis in acute leukemia:response to induction chemotherapy[J].Experimental and Molecular Pathology,2012,92(1):44-49.

[6] 莊靜麗，徐建民，王寶珍，等.急性白血病P-糖蛋白表達(dá)檢測及臨床意義[J].中國臨床醫(yī)學(xué)，2004，11(5):805-807.

[7] Guido Marcucci,Kati Maharry,Yue-Zhong Wu,et al.IDH1 and IDH2 Gene Mutations Identify Novel Molecular Subsets Within De Novo Cytogenetically Normal Acute Myeloid Leukemia:A Cancer and Leukemia Group B Study[J]. Journal of Clinical Oncology,2010,27(28):2348-2355.

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.6.052

江西 333000 江西省上饒市人民醫(yī)院 （葉筱穎）