鄧敏　解瑞飛　王惠.杭州市富陽區(qū)第一人民醫(yī)院病理科，浙江杭州3400；.杭州市腫瘤醫(yī)院信息科，浙江杭州3000

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FGFR-1、cyclinD1在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

鄧敏1解瑞飛2王惠1
1.杭州市富陽區(qū)第一人民醫(yī)院病理科，浙江杭州311400；2.杭州市腫瘤醫(yī)院信息科，浙江杭州310002

[摘要]目的探討成纖維生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR-1）及細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法應(yīng)用原位雜交及免疫組織化學(xué)S-P法檢測乳腺癌、乳腺纖維腺瘤和正常乳腺組織中FGFR-1、cyclinD1 mRNA及蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果在乳腺癌中，F(xiàn)GFR-1蛋白和FGFR-1基因的陽性率分別為70.0%（21/30）、70.0%（21/30），cyclinD1蛋白和cyclinD1基因的陽性率分別為66.7%（20/30）、76.7% （23/30），明顯高于纖維腺瘤與正常乳腺組織（P<0.05），F(xiàn)GFR-1表達(dá)與cyclinD1表達(dá)一致。結(jié)論FGFR-1的過表達(dá)在人類乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其機(jī)制可能通過上調(diào)cyclinD1的表達(dá)發(fā)揮作用，F(xiàn)GFR-1、cyclinD1的過度表達(dá)可作為判斷乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]FGFR-1；cyclin D1；乳腺癌；免疫組化；原位雜交

[Key woeds]FGFR-1;Cyclin D1;Breast carcinoma;Immunohistochemistry;In situ hybridization

成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）是由糖蛋白的胞外免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域、疏水跨膜區(qū)和含有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞質(zhì)部分組成。研究發(fā)現(xiàn)FGFR-1、FGFR-2基因表達(dá)于許多腫瘤細(xì)胞，與患者的預(yù)后密切相關(guān)。在甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤中均可見FGFR-1的高表達(dá)[1，2]。

細(xì)胞周期蛋白（cyclin）對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行正調(diào)控，與細(xì)胞生長、發(fā)育及腫瘤的發(fā)生關(guān)系極其密切。研究發(fā)現(xiàn)：在原發(fā)性乳腺腫瘤中，cyclinD1和FGFR-1的共同擴(kuò)增與患者存活顯著減少相關(guān)，表明這兩種蛋白之間存在相互作用[3，4]。然而目前FGFR-1在乳腺癌中的表達(dá)及其高表達(dá)是如何促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、與cyclinD1的關(guān)系如何，國內(nèi)尚無報(bào)道。本文采用原位雜交及免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)30例乳腺癌組織中cyclinD1和FGFR-1的mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集我院2007年3月～2014年8月手術(shù)切除的乳腺纖維腺瘤患者15例、乳腺癌患者30例。所有標(biāo)本術(shù)前均未進(jìn)行放化療，術(shù)后病理診斷為乳腺癌、纖維腺瘤。另取15例癌旁正常乳腺組織作對(duì)照?；颊吣挲g35～63歲，平均（46.0±3.2）歲，乳腺癌組伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例。30例乳腺癌標(biāo)本中，獲得滿5年隨訪者24例，其中已死亡病例6例，尚生存病例18例。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

（1）主要儀器：萊卡DM-3000顯微鏡、萊卡切片機(jī)RM2235、萊卡脫水機(jī)ASP300S等。

（2）主要試劑：FGFR-1、cyclinD1免疫組化和mRNA原位雜交試劑盒，均購自武漢博士德。

1.3方法

分別采用免疫組化和原位雜交法檢測FGFR-1、cyclinD1蛋白和mRNA的表達(dá)，免疫組化及原位雜交染色具體操作方法參照文獻(xiàn)[5，6]并嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。用己知陽性片作陽性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液分別代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷

FGFR-1、cyclinD1 mRNA陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，cyclinD1免疫組化陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，綜合染色強(qiáng)度和陽性腫瘤細(xì)胞的百分比進(jìn)行分級(jí)[5]。將染色強(qiáng)度分為：無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。將陽性腫瘤細(xì)胞的百分比分為：<10%為0分，10%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分。兩項(xiàng)相加后分陰性（-）和陽性（+）：0～1分為（-），2分以上為（+）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)法和Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1cyclin D1、FGFR-1 mRNA在各組中的表達(dá)

2.1.1cyclin D1在各組中的表達(dá)cyclin D1 mRNA 在30例乳腺癌中有23例呈陽性表達(dá)（圖1），正常對(duì)照組、纖維腺瘤組、乳腺癌組逐步增高，陽性率分別為20.0%（3/15）、33.3%（5/15）、76.7%（23/30），纖維腺瘤組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；乳腺癌組與纖維腺瘤組及對(duì)照組之間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.1.2FGFR-1 mRNA在各組中的表達(dá)FGFR-1 mRNA在30例乳腺癌中有21例呈陽性表達(dá)（圖2），正常對(duì)照組、纖維腺瘤組、乳腺癌組逐步增高，陽性率分別為13.3%（2/15）、20.0%（3/15）、70.0%（21/30），纖維腺瘤組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；乳腺癌組與纖維腺瘤組及對(duì)照組之間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）（表1）。

表1　FGFR-1和cyclinD1 mRNA的各組中的表達(dá)[n（%）]

2.2cyclin D1、FGFR-1蛋白在各組中的表達(dá)

2.2.1cyclin D1蛋白在各組中的表達(dá)cyclin D1蛋白在30例乳腺癌中有20例呈陽性表達(dá)（圖3），正常對(duì)照組、纖維腺瘤組、乳腺癌組逐步增高，陽性率分別為26.7%（4/15）、33.3%（5/15）、66.7%（20/30），纖維腺瘤組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；乳腺癌組與纖維腺瘤組及對(duì)照組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.2.2FGFR-1蛋白在各組中的表達(dá)FGFR-1蛋白在30例乳腺癌中有21例呈陽性表達(dá)（圖4），正常對(duì)照組、纖維腺瘤組、乳腺癌組逐步增高，陽性率分別為6.7%（1/15）、26.7%（4/15）、70.0%（21/30），纖維腺瘤組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；乳腺癌組與纖維腺瘤組及對(duì)照組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見表2）。

表2　FGFR-1和cyclinD1蛋白在各組中的表達(dá)[n（%）]

3　討論

乳腺癌在染色體8p11-8p12和11q12-11q14的共擴(kuò)增時(shí)常發(fā)生，表明在腫瘤形成過程中這些區(qū)域的基因之間可能存在合作。FGFR-1所在的染色體區(qū)域8p11.2，在腎癌、肺癌、前列腺癌中均擴(kuò)增[7]。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)FGFR-1在乳腺癌中擴(kuò)增（8p11.2～p12擴(kuò)增）[8，9]，F(xiàn)GFR-1和FGFR-2均為受體型酪氨酸激酶，主要分布于細(xì)胞膜表面。在細(xì)胞表面酪氨酸激酶受體呈單二聚體形式，在受體內(nèi)的蛋白具有酪氨酸激酶活性。當(dāng)FGFR與特異的酪氨酸激酶受體結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致形成穩(wěn)定的二聚體，隨后其下游信號(hào)通路的受體自身磷酸化和活化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，從而導(dǎo)致癌的發(fā)生[10]，與本研究一致，乳腺癌組織中FGFR-1蛋白的表達(dá)明顯增高[11]，顯著高于正常乳腺組織和良性乳腺腺瘤組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1?。?0x20）cyclin D1 mRNA在各組中的表達(dá)（A：對(duì)照組；B：纖維腺瘤組；C：乳腺癌組）

圖2?。?0x20）FGFR-1 mRNA在各組中的表達(dá)（A：對(duì)照組；B：纖維腺瘤組；C：乳腺癌組）

圖3?。?0x20）cyclin D1蛋白在各組中的表達(dá)（A：對(duì)照組；B：纖維腺瘤組；C：乳腺癌組）

圖4?。?0x20）FGFR-1蛋白在各組中的表達(dá)（A：對(duì)照組；B：纖維腺瘤組；C：乳腺癌組）

cyclinD1又名CCND1，定位于11q13區(qū)，即原癌基因，根據(jù)大量研究結(jié)果顯示：多種人類腫瘤存在11q13區(qū)擴(kuò)增現(xiàn)象[12]，而cyclinD1位于該區(qū)中間部位。cyclin D1轉(zhuǎn)基因鼠引起乳腺增生和乳腺上皮腫瘤，乳腺癌組織中cyclin D1的高表達(dá)將使腫瘤細(xì)胞增殖，從而使得腫瘤持續(xù)生長[13]。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中cyclin D1蛋白的表達(dá)明顯增高，顯著高于正常乳腺組織和良性乳腺腺瘤組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Etsu等[14]體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)：FGFR-1表達(dá)增加通過cyclin D1過表達(dá)激活pRB/E2F通路而參與乳腺癌的發(fā)生，首次提出cyclin D1/pRB/E2F通路參與調(diào)節(jié)成纖維生長因子受體的表達(dá)。有學(xué)者指出cyclin D/cdk4復(fù)合物可使FGFR的795號(hào)絲氨酸pRB激活磷酸化，使用FGFR抑制劑后，位于795號(hào)染色體的絲氨酸pRB磷酸化減弱，cyclin D/cdk4復(fù)合物活性被抑制。異位cyclin D1表達(dá)能夠拮抗FGFR-1抑制劑的抗增殖作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，因此本實(shí)驗(yàn)指出：FGFR-1介導(dǎo)的信號(hào)可能通過細(xì)胞周期蛋白D的調(diào)節(jié)連接于細(xì)胞周期，調(diào)控pRB磷酸化參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。為了增加實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性，本實(shí)驗(yàn)還采用原位雜交方法，檢測各組cyclin D、FGFR-1的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示兩種因子表達(dá)呈一致性，進(jìn)一步說明FGFR-1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)cyclinD1進(jìn)行調(diào)節(jié)。我們的研究結(jié)果提供證據(jù)表明：FGFR-1擴(kuò)增是高度增生乳腺癌的驅(qū)動(dòng)力之一，為乳腺癌新的治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)，F(xiàn)GFR-1抑制劑可能是有效的治療藥，不僅能抑制血管的生成，而且還抑制乳腺癌的生長[15-20]。

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Expression and clinical significance of FGFR-1,cyclinD1 in breast carcinoma

DENG Min1XIE Ruifei2WANG Hui1
1.Department of Pathology,the First People's Hospital of Fuyang District in Hangzhou City,Hangzhou311400,China;
2.Department of Information,Hangzhou Cancer Hospital,Hangzhou310002,China

[Abstract]Objective To study the expression and significance of FGFR-1,cyclinD1 in breast carcinoma.Methods In situ hybridization and immunohistochemistry S-P method were adopted to detect the expression of FGFR-1,cyclinD1 mRNA and protein level in cases of breast cancer,cases of breast fibroadenoma and cases of normal breast tissue.Results In breast carcinoma,the positive rates of FGFR-1 protein and FGFR-1 mRNA were 70.0%(21/30),70.0%(21/30), the positive rates of cyclinD1 protein and cyclinD1 mRNA were 66.7%(20/30),76.7%(23/30),respectively.It was found that the expression of FGFR-1,cyclinD1 in breast carcinoma was obviously higher than in fibroadenoma and normal tissue(P<0.05).The expression of FGFR-1 was coincidence with the cyclinD1.Conclusion The abnormal expression of FGFR-1 plays an important role in the carcinogenesis and progression of human breast carcinoma,the mechanism of which may be up-regulating the expression of cyclinD1.Abnormal expression of FGFR-1 and the overexpression of cyclinD1 could be considered as the useful makers for determining metastasis and prognosis of human breast carcinoma.

[中圖分類號(hào)]R737.9

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-9701（2016）04-0001-04

[基金項(xiàng)目]浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2015C 33268）；浙江省富陽市科技項(xiàng)目（富科[2011]22號(hào)）

收稿日期：（2015-11-11）