李 燕，朱 君

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

iNOS和VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)*

李 燕，朱 君

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

摘 要:目的:研究誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)的異位內(nèi)膜的表達(dá)。方法:采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測30例EMs異位內(nèi)膜與35例正常對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織中iNOS、VEGF的表達(dá)，了解異位內(nèi)膜組織中iNOS、VEGF表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:在EMs的異位內(nèi)膜組織中，iNOS和VEGF蛋白的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)；在EMs異位子宮內(nèi)膜組織中，iNOS和VEGF的表達(dá)成正相關(guān)(r= 0.895，P＜0.05)。結(jié)論:EMs中，異位內(nèi)膜組織的侵襲力增強(qiáng)及血管生成可能與iNOS、VEGF高表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:子宮內(nèi)膜異位癥； 誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶； 血管內(nèi)皮生長因子； 免疫組織化學(xué)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)發(fā)生發(fā)展中，一氧化氮(Nitric oxide，NO)參與其中。NO的產(chǎn)生需要一氧化氮合酶(NOS)的催化作用，本研究取材于EMs患者異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及其他婦科疾病的子宮內(nèi)膜，采用免疫組織化學(xué)方法檢測EMs組織中iNOS和VEGF的表達(dá)水平，研究EMs與NO及VEGF水平是否相關(guān)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象:選取2012年2月至20013年10月新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦科住院患者，選擇由科主任進(jìn)行腹腔鏡手術(shù)探查的子宮內(nèi)膜異位癥患者30例作為研究組，所有病例均根據(jù)手術(shù)所見及術(shù)后病理確診，病理切片診斷處于月經(jīng)周期的增生期18例，分泌期12例；患者年齡35～48歲；對(duì)照組選用因各種良性疾病在住院期間行腹腔鏡下子宮全切術(shù)35例，術(shù)后病理切片診斷是正常子宮內(nèi)膜，其中處于月經(jīng)周期的增生期22例，分泌期13例；患者年齡38～51歲。研究組和對(duì)照組在患者的年齡、子宮內(nèi)膜分期以及體重指數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異，兩組患者術(shù)前6個(gè)月內(nèi)無口服性激素類藥物史及宮內(nèi)節(jié)育器放置術(shù)史。

1.2方 法

1.2.1免疫組化所用試劑:兔多克隆IgG抗體iNOS，兔抗人VEGF多克隆抗體，SP免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，iNOS抗體稀釋濃度1∶200，VEGF抗體稀釋濃度為1:100。

1.2.2免疫組化檢測:在手術(shù)中采集標(biāo)本，即EMs的異位子宮內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜，經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，每張約4μm厚度，一式4份。l份制作HE染色切片，3份用做免疫組化試驗(yàn)。按試劑盒操作說明書進(jìn)行，并且檢測VEGF及iNOS在組織的分布，對(duì)照組用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.3免疫組化圖像分析標(biāo)準(zhǔn):采用HPIAS-1000高清晰度病理圖文分析系統(tǒng)，在400倍高倍鏡下觀察每個(gè)標(biāo)本，隨機(jī)取5個(gè)視野，切片中細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒為iNOS和VEGF陽性細(xì)胞，測量iNOS和VEGF陽性細(xì)胞的染色灰度，用相應(yīng)背景灰度值與各測量點(diǎn)灰度值相減，最后的平均值作為最終灰度值，檢測光密度值(OD)以及iNOS和VEGF陽性表達(dá)面積與統(tǒng)計(jì)面積之比的面密度(area densities，AD)，并采用OD均值及面密度均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，變量間的相關(guān)分析，P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，灰度值組間比較采用成組設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1iNOS和VEGF的表達(dá):在正常子宮內(nèi)膜組織腺上皮的表達(dá)中呈弱陽性，高倍顯微鏡下觀察可見細(xì)胞及組織著淺黃色呈散在分布；iNOS和VEGF在EMs中在位內(nèi)膜組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，主要分布在腺上皮細(xì)胞中，少量在間質(zhì)，鏡下細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色成片或灶狀分布。

表1　子宮內(nèi)膜異位癥與對(duì)照組子宮內(nèi)膜中iNOS和eNOS的OD值比較

2.2EMs子宮內(nèi)膜組織中iNOS和VEGF的表達(dá):iNOS和VEGF表達(dá)的面密度:試驗(yàn)組EMs在位內(nèi)膜組織的腺上皮及間質(zhì)有片狀及灶狀強(qiáng)陽性iNOS和VEGF表達(dá)，而對(duì)照組正子宮內(nèi)膜組織腺上皮及間質(zhì)中iNOS和VEGF表達(dá)呈散在分布，兩者面密度之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2　比較兩組子宮內(nèi)膜組織中iNOS和VEGF的面密度

2.3iNOS與VEGF表達(dá)的相關(guān)性:EMs在異位內(nèi)膜組織中iNOS和VEGF呈強(qiáng)陽性表達(dá)，但對(duì)照組中，正常子宮內(nèi)膜組織中iNOS和VEGF呈弱陽性表達(dá)，變量間的相關(guān)分析選用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，iNOS和VEGF表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析，r = 0.895，P＜0.05，表明iNOS和VEGF呈明顯正相關(guān)，在EMs中，iNOS可促進(jìn)VEGF的表達(dá)，增加血管形成。

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)的發(fā)病機(jī)制中“經(jīng)血逆流”是主導(dǎo)學(xué)說，近年證實(shí)，90%女性均有經(jīng)血逆流，但其中只有10%女性發(fā)生EMs[1]。說明經(jīng)血逆流只是病因，而子宮內(nèi)膜在腹腔內(nèi)種植，血液供應(yīng)的建立和支持是必不可少的，血管生成與EM的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，最重要的促血管生成因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[2]。VEGF具有促血管形成的功能[3]，VEGF是高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，在月經(jīng)周期中，參與子宮內(nèi)膜血管的形成。在病理情況下，VEGF與血管過度生成密切關(guān)系。VEGF的主要生理功能有[4，5]:①能促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂，降解細(xì)胞外蛋白和基底膜，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移并增生。②增加血管的通透性，為血管芽延伸生長提供良好基質(zhì)。③在細(xì)胞漿內(nèi)，快速短暫地增加鈣離子濃度，刺激磷脂酰肌醇的磷酸化，上調(diào)信號(hào)通路的表達(dá)。

VEGF受雌激素、細(xì)胞因子、缺氧因子等調(diào)節(jié)，在眾多調(diào)節(jié)因素中，NO也參與了VEGF的調(diào)節(jié)。Kimura 等[6]發(fā)現(xiàn)NO具有類似低氧對(duì)VEGF的調(diào)節(jié)效應(yīng)，NO與低氧誘導(dǎo)因子-1的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，然后與VEGF啟動(dòng)子調(diào)控元件結(jié)合，增加VEGF的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)局部血管的形成，并提高組織對(duì)缺氧的耐受性。

1979年首次發(fā)現(xiàn)NO，NO是內(nèi)源性的血管舒張因子，半衰期很短，約5～10s。體內(nèi)NO的生成量取決細(xì)胞內(nèi)NO前體L-Arg的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量與胞漿NOS的活性。它的產(chǎn)生需要一氧化氮合酶(NOS)的催化作用。在人體內(nèi)，L -精氨酸(L -Arg)經(jīng)一氧化氮合成酶(NOS)氧化生成NO，反應(yīng)另一產(chǎn)物是L -瓜氨酸。NOS有三種同工酶，內(nèi)皮型NOS(eNOS)、神經(jīng)型NOS (nNOS)和誘導(dǎo)型NOS(iNOS)。

iNOS存在于巨噬細(xì)胞中，正常時(shí)不表達(dá)。但在EMs中，被各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)，如TNF-α，IL-1等，是非Ca2+依賴的鈣結(jié)合蛋白的酶，活性維持?jǐn)?shù)小時(shí)至數(shù)天，催化生成大量NO，水平高達(dá)10-6～10-9mmoL/ L水平。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明在EMs中，異位子宮內(nèi)膜腺上皮iNOS的表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，表明患有EMs，其異位子宮內(nèi)膜合成NO水平較正常子宮內(nèi)膜明顯增高，在EMs異位內(nèi)膜中，iNOS和VEGF的表達(dá)呈明顯正相關(guān)。

NO增加了血管壁的通透性，使單核巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞系從血管內(nèi)外游至血管外，形成局部炎癥，外游至血管外的單核巨噬細(xì)胞活化，經(jīng)iNOS催化，不斷產(chǎn)生NO，同時(shí)NO不斷誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞，兩者相互作用，使局部形成炎癥。在EMs中，NO引發(fā)的局部炎癥、上調(diào)VEGF的表達(dá)，新生血管增加，促使異位子宮內(nèi)膜在腹腔種植，生長，促進(jìn)EMs的進(jìn)展；同時(shí)，NO代謝的產(chǎn)物是NO-2/ NO-3，是NO發(fā)揮生理作用的代謝途徑；另一種途徑生成過氧亞硝酸根(ONOO-)，發(fā)揮NO的毒性作用。在EMs中，iNOS增高，誘使NO表達(dá)增高，增加血管壁的通透性，形成局部炎性反應(yīng)。同時(shí)，NO可上調(diào)VEGF的表達(dá)，在EMs，iNOS和VEGF相互調(diào)節(jié)，促進(jìn)EMs的發(fā)生發(fā)展。因此抑制iNOS對(duì)VEGF調(diào)控，可能為EMs的治療開辟一個(gè)新的途徑。

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論著

Expression of iNOS and VEGF in Endometriosis

LI Yan，ZHU Jun
(The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Xinjiang Wulumuqi 830000，China)

Abstract:Objective:To investigate the expression of iNOS and VEGF in endometriosis(EMs).Method:Immunochemical method was used to determine the expression of iNOS and VEGF in ectopic endometrium with EMs and the endometrium of controls.Result:The expression of iNOS and VEGF in endometriosis was significantly higher than that of normal endometrium.In ectopic endometrial，the expression of iNOS and VEGF was positively related (r = 0.895，P＜0.05).Conclusion:iNOS and VEGF plays an important role in the progression of endometriosis.

Key words:Endometriosis； iNOS； VEGF； Immunohistochemistry

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

doi:10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.01.003

文章編號(hào):1006-6233(2016)01-0007-03

*基金項(xiàng)目:新疆維吾爾自治區(qū)科技攻關(guān)和重點(diǎn)計(jì)劃項(xiàng)目，(編號(hào):200633146-4)