朱芹英，張卉，楊鐵驪

（1.青海省西寧市第一人民醫(yī)院藥劑科，青海西寧810000；2.河南省黃淮學院，河南駐馬店463000）

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桂枝提取物對動脈粥樣硬化大鼠白細胞介素6/信號轉導子和轉錄活化子3信號通路的影響

朱芹英1，張卉2，楊鐵驪2

（1.青海省西寧市第一人民醫(yī)院藥劑科，青海西寧810000；2.河南省黃淮學院，河南駐馬店463000）

摘要：目的分析桂枝提取物對動脈粥樣硬化（AS）大鼠白細胞介素6/信號轉導子和轉錄活化子3（IL-6/ STAT3）信號通路的影響。方法選取健康純種SD雄性大白鼠共366只，隨機分為正常對照組、空白AS模型組和桂枝提取物組。免疫組織化學法檢測Toll樣受體4（TLR4）、肝臟X受體（LXR）、C-Jun的N末端激酶（JNK/P-JNK）、細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK1/2/P-ERK1/2）、P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK/p-P38MAPK）、白細胞介素6（IL-6）、蛋白質酪氨酸激酶JAK-1抗原（JAK1/p-JAK1）、轉錄活化子3（STAT3/p-STAT3）及核轉錄因子kappa B（NF-κB）P65的表達在AS大鼠腹主動脈中的表達；用實時熒光定量PCR技術檢測AS大鼠腹主動脈血管AGTRl mRNA和IL-6 mRNA的表達。結果與正常對照組比較，空白模型組腹主動脈血管IL-6陽性表達率明顯升高（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組IL-6的陽性表達率顯著降低（P ＜0.05）。與正常對照組比較，空白模型大鼠腹主動脈血管IL-6 mRNA的表達顯著升高（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組IL-6 mRNA的表達顯著降低（P＜0.05）。與正常對照組比較，空白模型組腹主動脈p-JAK1陽性表達率顯著提高，p-STAT3陽性表達率顯著降低（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組p-JAK1陽性表達率顯著降低，p-STAT3陽性表達率顯著升高（P＜0.05）。結論桂枝提取物可以通過降低TLR4水平，升高LXR水平，同時抑制JNK、p38MAPK和ERK1/2的磷酸化，作用于NF-κB轉錄因子，抑制IL-6分泌，進而影響JAK2/STAT3信號轉導通路。

關鍵詞：動脈粥樣硬化；桂枝提取物；信號通路轉導

動脈粥樣硬化（athcrosclerosis，AS）是以動脈硬化為主要病變的血管疾病，受累動脈多從內膜開始病變。發(fā)病患者一般均優(yōu)先出現(xiàn)脂質、血栓、復合糖類集聚物、纖維組織增生及鈣沉淀等癥狀，這些物質將在病變動脈逐步退變、鈣化，累及血管彈性［1］。當疾病發(fā)展至阻塞動脈血管時，該動脈及其負責供血區(qū)域將極易出現(xiàn)組織器官缺血、缺氧及壞死情況，患者將出現(xiàn)腦中風或心肌梗塞等癥狀，嚴重影響患者生命健康［2］。桂枝提取物是中醫(yī)常用藥物之一，主要用于治療風寒感冒、血塞經(jīng)閉、心悸或關節(jié)痹痛等癥狀。為分析桂枝提取物在AS治療中的療效，并探究其對AS大鼠白細胞介素6/信號轉導子和轉錄活化子3（IL-6/STAT3）信號通路的影響，筆者進行如下研究。

1　材料與方法

1.1實驗材料

選取健康純種SD雄性大白鼠共366只（購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），每只均為200～250克，隨機分為正常對照組、空白AS模型組和桂枝提取物組。其中，正常對照組予以普通飼料和自來水喂養(yǎng)；空白AS模型組和桂枝提取物組采用高脂飼料喂養(yǎng)，同時在喂養(yǎng)第7天行大鼠主動脈內膜球囊損傷術。桂枝提取物組在建模后第3天予以桂枝提取物給藥（西安天瑞生物技術有限公司，規(guī)格：10∶1），給藥體積為2 ml/kg，按照19 mg/kg給藥，1次/d，持續(xù)給藥16周；其余兩組予以生理鹽水給藥。16周后，麻醉動物，取0.5 cm長度腹主動脈標本。其中，桂枝提取物為：取桂枝粉末0.5 g，加乙醇10 ml，密塞，浸泡20 min，時時振搖，濾過，濾液作為供試品溶液。

1.2主要實驗儀器

兔抗人多克隆TLR4抗體及兔抗人多克隆LXR抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司，磷酸化p-JNK兔多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗人ERK1/2單克隆抗體及兔抗人p-ERK1/2單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Anti-phospho-p38 MAPK磷酸化p38MAPK抗體及鼠抗人p38MAPK單克隆抗體購自上海瑞齊生物科技有限公司，酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒由上海哈靈生物科技有限公司提供，兔抗人多克隆抗體JAK1及p-STAT3和SP免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗人多克隆NFКB P65/p-NF-κB P65抗體及大鼠白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）免疫組織化學試劑盒購自上海安妍生物有限公司，PCR儀（abi7900HT）購自APPLIED BIOSYSTEMS公司、凝膠圖像分析儀和分光光度儀（UV-photometer型）購自上海精宏實驗儀器廠，電泳儀和恒溫水浴箱（DK-S22型）購自北京六一儀器廠，低溫高速離心機購自上海梅特勒托力多儀器有限公司，光學顯微鏡購自日本Olympus公司，切片機購自德國DELICA公司。

1.3實驗方法

造模16周后給予大鼠禁食12 h，麻醉，腹腔采血，勁椎脫位處死大鼠，分離頸總動脈，取主動脈弓起始端1.0 cm動脈，多聚甲醛固定12 h，打開大鼠腹腔，分離皮膚、脂肪組織，沿主動脈背部剪開，取2.0 cm腹動脈，沖洗，-80℃冰箱保存待檢。將主動脈標本選用乙醇脫水，包膜，制片，HE染色操作，顯微鏡下觀察動脈管壁形態(tài)學變化。將腹動脈標本沖洗后，選用油紅O染色，檢測標本內中性三酰甘油、脂質蛋白情況。

免疫組織化學法檢測Toll樣受體4（Toll like receptors 4，TLR4）、肝臟X受體（liver X receptor，LXR）、C-Jun的N末端激酶（JNK/P-JNK）、細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2/P-ERK1/2）、P38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，P38MAPK/p-P38 MAPK）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、蛋白質酪氨酸激酶JAK-1抗原（tyrosine protein kinase JAK1，JAK1/p-JAK1）、轉錄活化子3（activator of transcription 3，STAT3/p-STAT3）及核轉錄因子kappa B（NF-κB/p-NF-κB）P65的表達在AS大鼠腹主動脈中的表達；用實時熒光定量PCR技術檢測AS大鼠腹主動脈血管AGTR1 mRNA和IL-6 mRNA的表達。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用X2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差（x± s）表示，采用t檢驗；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1TLR4、LXR在不同大鼠腹主動脈中的表達

TLR4、LXR在不同大鼠腹主動脈中的表達，見表1。和正常對照組比較，空白模型組腹主動脈TLR4陽性表達率顯著升高（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組TLR4陽性表達率顯著降低（P＜0.05）。與正常對照組比較，空白模型組腹主動脈LXR陽性表達率顯著降低（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組LXR蛋白陽性表達率升高（P＜0.05）。

2.2JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2和P38MAPK/ p-P38MAPK在不同大鼠腹主動脈中的表達

JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2和P38MAPK/p-P38MAPK在不同大鼠腹主動脈中的表達，見表2。磷酸化前，與正常對照組比較，空白模型組腹主動脈JNK、ERK1/2和P38MAPK陽性表達率顯著增高（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組JNK、ERK1/2和P38MAPK陽性表達率顯著下降（P＜0.05）。磷酸化后，與正常對照組比較，空白模型組腹主動脈P-JNK、P-ERK1/2和p-P38MAPK陽性表達率顯著增高（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組P-JNK、P-ERK1/2和p-P38MAPK陽性表達率顯著降低（P＜0.05）。

表1　TLR4、LXR在不同大鼠腹主動脈中的表達　例（%）

表2　JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2和P38MAPK/p-P38MAPK在不同大鼠腹主動脈中的表達（±s）

表2　JNK/P-JNK、ERK1/2/P-ERK1/2和P38MAPK/p-P38MAPK在不同大鼠腹主動脈中的表達（±s）

注：與?空白模型組比較，P＜0.05

組別　JNK/P-JNK　ERK1/2/P-ERK1/2　P38MAPK/p-P38MAPK　 X2值　P值正常對照組（n=180）　?。?1.53±1.98）/（22.12±2.89）??。?.11±0.25）/（0.08±0.02）??。?.40±0.07）/（1.03±0.11）?　2.791　 0.023空白模型組（n=92）　　（46.96±9.11）/（58.78±11.51）?。?.99±0.18）/（0.49±0.11）?。?.44±0.14）/（1.37±0.16）　3.411　 0.002桂枝提取物組（n=94）　（17.88±3.41）/（23.31±5.01）??。?.69±0.11）/（0.23±0.02）?　（0.64±0.05）/（0.63±0.07）?　4.562.　 0.017

2.3AGTR1 mRNA在不同大鼠腹主動脈中的表達

AGTR1 mRNA在不同大鼠腹主動脈中的表達，見表3。與正常對照組比較，空白模型組腹主動脈AGTR1 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組AGTR1 mRNA水平顯著降低，（P＜0.05），擴增倍數(shù)為0.81。

2.4NF-κB P65和p-NF-κB P65在不同大鼠腹主動脈中的表達

NF-κB P65和p-NF-κB P65在不同大鼠腹主動脈中的表達，見表4。磷酸化前，與正常對照組比較，空白模型組腹主動脈NF-κB P65陽性表達率顯著增高（P＜0.05）；和空白模型組比較，桂枝提取物組腹主動脈NF-κB P65陽性表達率顯著降低（P＜0.05），磷酸化后，與正常對照組比較，空白模型組腹主動脈p-NF-κB P65陽性表達率顯著增高（P＜0.05）；和空白模型組比較，桂枝提取物組腹主動脈p-NF-κB P65陽性表達率顯著降低（P＜0.05）。

2.5IL-6和IL-6 mRNA在不同大鼠腹主動脈中的表達

IL-6和IL-6 mRNA在不同大鼠腹主動脈中的表達，見表5。與正常對照組比較，空白模型組腹主動脈血管IL-6陽性表達率顯著升高（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組IL-6的陽性表達率顯著降低（P＜0.05）。與正常對照組比較，空白模型大鼠腹主動脈血管IL-6 mRNA的表達顯著升高（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組IL-6 mRNA的表達顯著降低（P＜0.05）。

2.6JAK1/p-JAK1和STAT3/p-STAT3在不同大鼠腹主動脈中的表達

JAK1/p-JAK1和STAT3/p-STAT3在不同大鼠腹主動脈中的表達，見表6。與正常對照組比較，空白模型組腹主動脈JAK1/p-JAK1陽性表達率顯著提高，STAT3/p-STAT3陽性表達率顯著降低（P＜0.05）；與空白模型組比較，桂枝提取物組JAK1/p-JAK1陽性表達率顯著降低，STAT3/p-STAT3陽性表達率顯著升高。

表3　AGTRl mRNA在不同大鼠腹主動脈中的表達（±s）

表3　AGTRl mRNA在不同大鼠腹主動脈中的表達（±s）

注：與?空白模型組比較，P＜0.05

組別　AGTRl mRNA抑制率（%）X2值　P值正常對照組（n=180）　1.27±0.34?空白模型組（n=92）　28.52±4.33桂枝提取物組（n=94）24.95±3.09?　12.52　 3.451　 0.011

表4　NF-κB P65和p-NF-κB P65在不同大鼠腹主動脈中的表達　例（%）

表5　IL-6和IL-6 mRNA在不同大鼠腹主動脈中的表達

表6　JAK1/p-JAK1和STAT3/p-STAT3在不同大鼠腹主動脈中的表達（±s）

表6　JAK1/p-JAK1和STAT3/p-STAT3在不同大鼠腹主動脈中的表達（±s）

注：與?空白模型組比較，P＜0.05

組別　JAK1/p-JAK1　 STAT3/p-STAT3 X2值　P值正常對照組（n=180）（0.48±0.07）/ （0.13±0.02）?（0.57±0.12）/ （0.19±0.05）?　2.183 0.021 （n=92）　?。?.58±0.13）/ （0.87±0.16）　?。?.21±0.08）/ （0.13±0.07）　3.976 0.001桂枝提取物組（n=94）空白模型組（0.42±0.06）/ （0.17±0.08）?（0.27±0.05）/ （0.19±0.06）?　4.459 0.003

3　討論

AS與高血壓、高血脂、吸煙、糖尿病及肥胖等有關，發(fā)病患者癥狀與病變動脈位置以及附近器官受累缺血程度有關［3］。主動脈動脈粥樣硬化患者常無明顯癥狀，而AS患者，如狹窄直徑超過75%，患者將合并心肌梗塞、心率失常及心絞痛，甚至猝死；腦動脈粥樣硬化則可能引發(fā)腦中風、腦萎縮癥狀；腎臟動脈粥樣硬化可能引發(fā)頑固性高血壓、腎功能不全等癥狀；下肢動脈粥樣硬化可能引發(fā)跛行、壞疽癥狀［4］。圍繞AS的發(fā)生先后提出了很多學術意見，目前普遍認為AS是一種慢性炎癥性疾病，由內皮細胞開啟，過量低密度脂蛋白膽固醇聚集在血管皮下，導致白細胞滲出，血管平滑肌細胞增殖形成的病理性炎癥反應過程。白細胞介素6/信號轉導子和轉錄活化子3（IL-6/STAT3）信號通路，參與體內AS形成的病理生理反應，是具有治療靶點潛力的細胞蛋白調節(jié)因子，主要分為促炎和抗炎性兩類［5-6］。

IL-6是白細胞介素的一種，該物質廣泛存在于機體內，包括多種淋巴及非淋巴細胞均可分泌IL-6，如上皮細胞、血管內皮細胞、B細胞、T細胞等［7］。這些細胞在分泌IL-6時可受多種因素調節(jié)，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factors，TNF-α）、IL-1可增強呈纖維細胞合成IL-6；IL-4、糖皮質激素可促進單核巨噬細胞合成IL-6等。具有增強免疫反應細胞增殖、分化能力，并提高其功能的效用［8-9］。STAT3及Janus激酶信號通路是多種炎癥因子的激活途徑，該信號途徑與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路共同參與、介導了多種細胞的反應，對炎癥發(fā)生、發(fā)展具有重要調節(jié)作用［10］。

中醫(yī)理論中動脈粥樣硬化與痹癥有關，患者多因陽氣不足，水氣痰飲及陰邪居于陽位，血痰互瘀，梗阻經(jīng)脈，不通則痛，故治療需以化瘀活血、化痰通絡及清熱解毒為主［5］。桂枝提取物是中醫(yī)常用血寒經(jīng)閉、痰飲、心悸、關節(jié)痹痛及風寒感冒治療藥物，本品性溫，味辛、甘，歸心、肺和膀胱經(jīng)，具有發(fā)汗解肌、助陽化氣及溫通經(jīng)脈值療效，故臨床常用于治療AS。

為分析桂枝提取物對動脈粥樣硬化AS大鼠白細胞介素6/信號轉導子和轉錄活化子3（IL-6/STAT3）信號通路的影響，筆者進行了本次研究。本研究發(fā)現(xiàn)空白模型組腹主動脈血管IL-6表達顯著升高，桂枝提取物組IL-6的水平顯著降低。且空白模型大鼠腹主動脈血管IL-6 mRNA的表達顯著升高，桂枝提取物組IL-6 mRNA的表達顯著降低，這表明IL-6是動脈粥樣硬化病變的重要參與因子，而桂枝提取物質量可顯著降低大鼠IL-6含量，改善大鼠癥狀。同時本研究還發(fā)現(xiàn)與空白模型組腹主動脈p-JAK1陽性表達率顯著提高，p-STAT3陽性表達率顯著降低，且與空白模型組比較，桂枝提取物組p-JAK1陽性表達率顯著降低，p-STAT3陽性表達率顯著升高，這表明桂枝提取物可通過JAK1/ STAT3信號途徑抵抗動脈粥樣硬化。

綜上所述，桂枝提取物是一種有效的抗動脈粥樣硬化藥物，其可調節(jié)TLR4、LXR、JNK、p38MAPK、ERK1/2、NF-κB及IL-6等細胞因子的表達，并影響JAK2/STAT3通路。

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（王榮兵編輯）

論著

Impact Guizhi extract on IL-6/STAT3 signaling pathway in atherosclerotic rats

Qin-ying Zhu1，Hui Zhang2，Tie-li Yang2
（1. Department of Pharmacy，the First People's Hospital of Xining City，Xining，Qinghai 810000，China；2. Henan Huanghuai College，Zhumadian，Henan 463000，China）

Abstract：Objective To analyze effect of Guizhi extraction on the interleukin-6/signal transducer and activator of transcription 3（IL-6/STAT3）signaling pathway in atherosclerosis（AS）rats. Methods Totally 366 healthy purebred male SD rats were randomly divided into normal control group，blank AS model group and Guizhi extract group. Immunohistochemistry was used to detect TLR4，LXR，JNK/p-JNK，ERK1/2/P-ERK1/2，P38MAPK/p-P38MAPK，IL-6，JAK1/p-JAK1，STAT3/p-STAT3 and NFКB P65/ p-NFКB P65 expressions in rats with aortic AS. Real-time PCR was used to detect AGTRl mRNA and IL-6 mRNA expressions in abdominal aorta of AS rats. Results Compared with the normal control group，vascular IL-6 expression was significantly increased in the abdominal aorta of the blank model group（P＜0.05）；compared with the blank model group，the level of IL-6 in the Guizhi extract group was significantly reduced（P＜0.05）. Compared with the normal control group，the positive IL-6 mRNA expression rate in the abdominal aorta was significantly increased in the blank model group（P＜0.05）. Compared with the blank model group，IL-6 mRNA expression was significantly lowered in the Guizhi extract group（P＜0.05）. Compared with the normal control group，abdominal aortic p-JAK1 level significantly increased，p-STAT3 level sig-book=12,ebook=17nificantly lowered in the blank model group（P＜0.05）. Compared with the blank model group，p-JAK1 level significantly reduced and p -STAT3 level significantly increased in the Guizhi extract group（P＜0.05）. Conclusions Guizhi extract can inhibit IL-6 secretion，thereby affect JAK2/STAT3 signal transduction pathway by reducing TLR4 level，increasing LXR level while suppressing phosphorylation of JNK，p38MAPK and ERK1/2 and acting on the NFКB transcription factor.

Keywords：atherosclerosis；Guizhi extract；signal transduction pathway

中圖分類號：R-332

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.003

文章編號：1005-8982（2016）10-0011-05

收稿日期：2015-10-08

［通信作者］楊鐵驪，E-mail：1294881139@qq.com