卜林，陳艷

（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.重癥醫(yī)學(xué)科，2.腎臟內(nèi)科，江蘇徐州221003）

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鹽酸右美托咪啶對(duì)缺血再灌注腎損傷小鼠的腎小管保護(hù)作用

卜林1，陳艷2

（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.重癥醫(yī)學(xué)科，2.腎臟內(nèi)科，江蘇徐州221003）

摘要：目的缺血再灌注腎損傷（IR）是圍手術(shù)期常見的疾病，本研究通過構(gòu)建缺血再灌注腎損傷模型，觀察右美托咪啶（Dex）注射對(duì)受損腎小管的保護(hù)作用及機(jī)制。方法將60只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、IR模型組和IR+Dex組（簡(jiǎn)稱Dex組），制備IR模型后24 h分別處死3組小鼠取腎組織。用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血肌酐（Scr）及尿素氮（BUN）。采用HE染色觀察各組小鼠腎組織的形態(tài)，評(píng)定腎小管損傷程度；免疫組織化學(xué)染色測(cè)定低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達(dá)。結(jié)果對(duì)照組的腎小管結(jié)構(gòu)與形態(tài)均正常。IR模型組腎小管損害明顯、HIF-1α及MCP-1表達(dá)均增高。而Dex組腎小管損害程度較輕，HIF-1α及MCP-1表達(dá)均較IR模型組減低，腎小管上皮細(xì)胞低氧程度及炎癥反應(yīng)均較IR模型組明顯減輕。Dex組小鼠的血肌酐及尿素氮水平較IR模型組明顯降低。結(jié)論Dex可以通過抑制炎癥反應(yīng)、減輕腎小管上皮細(xì)胞低氧程度從而減輕IR小鼠腎小管的損害，保護(hù)腎臟功能。

關(guān)鍵詞：缺血再灌注損傷；腎小管上皮細(xì)胞；右美托咪啶

圍手術(shù)期急性腎損害（acute kidney injury，AKI）主要由包括手術(shù)在內(nèi)的各種原因引起的腎臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）所致，表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率急劇減少，出現(xiàn)氮質(zhì)血癥［1］。AKI是圍手術(shù)期常見的并發(fā)癥之一，也是重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU）常見的急危重癥。腎臟缺血再灌注不僅使自身受損，還導(dǎo)致多器官功能障礙。盡管目前診治手段大大改善，但AKI的發(fā)病率和病死率仍居高不下，造成住院時(shí)間延長(zhǎng)，診治費(fèi)用增加，死亡率增高。

右美托咪啶（Dexmedetomidine，Dex）是一種新型的、特異性、高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗交感、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)和利尿作用［2-3］，目前主要用于ICU鎮(zhèn)靜和臨床麻醉。本實(shí)驗(yàn)通過觀察Dex注射對(duì)受損腎小管的保護(hù)作用及其機(jī)制，旨在為臨床圍手術(shù)期防治AKI發(fā)生提供新的理論和應(yīng)用依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物昆明小鼠60只，清潔級(jí)，體重20～25 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2主要試劑兔抗免疫組織化學(xué)染色測(cè)定低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），β-Tubulin（美國(guó)Santa Cruz公司），兔抗單核細(xì)胞趨化蛋白1（mononuclear macrophage antigen 1，MCP1）單克隆抗體（Boster Biotechnology公司）。

1.2方法

1.2.1模型制備與分組將60只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、IR模型組和Dex組，每組20只。對(duì)照組：不做任何處理；IR模型組：用1.5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉小鼠后將其放置于變溫毯上，維持體溫（36.0±0.1）℃。常規(guī)備皮、消毒。沿腹部正中剪開皮膚，暴露腹白線，沿之剪開后暴露腹腔。輕輕推移腎周組織后分別用微血管夾夾閉左、右側(cè)腎蒂，可以看到兩側(cè)腎臟顏色由鮮紅變成暗紅。然后將腎周組織歸位，開放的腹腔用濕紗布覆蓋。待雙側(cè)腎臟缺血25 min后，移除微血管夾，讓腎臟重獲血液灌注，可以看到腎臟顏色由暗紅變成鮮紅?？p合關(guān)閉腹腔。24 h后處死小鼠，取出腎組織備檢。Dex組：在IR模型組中腎臟獲得再灌注后立即給予腹腔注射Dex 25.0μg/kg。

1.2.2腎組織形態(tài)學(xué)檢查常規(guī)石蠟包埋，組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-esosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀察。腎小管損傷程度分析：每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野分別測(cè)量腎小管間質(zhì)相對(duì)面積，按照DJUDJAJ等［4］方法，按腎小管損傷程度將組織學(xué)評(píng)分分為0～3：0=正常腎組織；1=中等程度損傷；3=腎小管壞死病變。進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。

1.2.3HIF-1α及MCP1的表達(dá)標(biāo)本石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度3μm。貼附于載玻片上，60℃烤箱烘烤3 h。常規(guī)脫蠟至水后，分別經(jīng)3%過氧化氫H2O2封閉，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。一抗：兔抗HIF-1α多克隆抗體（1∶100）、兔抗MCP1單克隆抗體（1∶100）；二抗：IgG即用型M.0.M.TM免疫組織化學(xué)試劑盒，按ABC法進(jìn)行染色，DAB顯色。均采用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），利用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算其積分光密度值（integral optical density，IOD），取其平均值。

1.2.4Western blot檢測(cè)HIF-1α表達(dá)取新鮮腎組織加裂解液后勻漿、離心、取上清液測(cè)蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗、二抗，顯色劑顯色處理。以β-Tubulin為參照，測(cè)定HIF-1α蛋白的相對(duì)表達(dá)量，即各組HIF-1α/β-Tubulin ratio值之間比較。

1.2.5腎功能變化在處死小鼠同時(shí)每只取靜脈血2 ml，在高速離心機(jī)上離心，吸取血清，在全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)BUN及Scr。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述；組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腎臟形態(tài)學(xué)變化

各組小鼠腎組織HE染色顯示：對(duì)照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常；IR模型組出現(xiàn)不同程度的腎小管擴(kuò)張萎縮、空泡變性，腎小管上皮細(xì)胞扁平、核染色缺失、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Dex組小鼠腎臟組織病理改變較IR模型組明顯減輕。見圖1。

各組小鼠腎臟組織組織學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示：對(duì)照組（0.23±0.01），IR模型組（4.46±0.11），Dex組（1.51± 0.04），3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

2.2腎組織HIF-1α免疫組織化學(xué)染色

對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞基本正常，HIF-1α表達(dá)微弱。IR模型組腎小管上皮細(xì)胞低氧嚴(yán)重，HIF-1α表達(dá)顯著增多。Dex組小鼠腎臟組織病理改變較IR模型組明顯減輕，HIF-1α表達(dá)較IR模型組顯著減少。見圖3。

各組小鼠腎組織HIF-1α染色I(xiàn)OD值比較，IR模型組腎小管HIF-1α大量表達(dá)，而Dex組HIF-1α較IR模型組表達(dá)顯著減少。3組標(biāo)本IOD值間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

2.3腎組織MCP1免疫組織化學(xué)染色

對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞基本正常，MCP1表達(dá)微弱。IR模型組腎小管損傷嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，MCP1表達(dá)顯著增多。Dex組小鼠腎臟組織病理改變較IR模型組顯著減輕，MCP1表達(dá)較IR模型組顯著減少。見圖5。

與對(duì)照組比較，IR模型組腎小管MCP1大量表達(dá)（P=0.042）。而Dex組MCP1較IR模型組表達(dá)顯著減少（P=0.031）。3組標(biāo)本IOD值間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6，表1。

2.4HIF-1α蛋白表達(dá)

對(duì)照組HIF-1α蛋白表達(dá)微弱，IR模型組HIF-1α蛋白大量表達(dá)，而Dex組HIF-1α蛋白表達(dá)水平較IR模型組顯著降低。見圖7。

圖1　各組小鼠腎組織HE染色（×40）

圖2　各組小鼠腎小管損傷程度組織學(xué)評(píng)分

圖3　各組小鼠腎組織HIF-1α染色（×40）

圖4　各組小鼠腎組織HIF-1α染色I(xiàn)OD值比較

圖5　各組小鼠腎組織MCP1染色（×40）

圖6　各組小鼠腎組織MCP1染色I(xiàn)OD值比較

各組HIF-1α/β-Tubulin ratio值之間比較：對(duì)照組HIF-1α蛋白表達(dá)微弱，HIF-1α/β-Tubulin ratio值小，IR模型組HIF-1α蛋白大量表達(dá)，HIF-1α/β-Tubulin ratio值顯著增加，而Dex組HIF-1α蛋白表達(dá)水平較IR模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖8。

2.5腎功能變化

雙腎缺血25 min再灌注24 h后，血漿肌酐水平從（30.62±2.55）μmol/L升高至（78.34±5.17）μmol/L（P =0.004），血尿素氮水平從（6.26±0.34）mmol/L升高至（23.39±4.15）mmol/L（P=0.006）。缺血再灌注后應(yīng)用Dex 25μg/kg，可顯著改善IR之后的腎功能，肌酐（54.09±3.27）μmol/L（P=0.035）；尿素氮（18.33±4.07）mmol/L（P=0.023）。見表2。

表1　各組小鼠24 h免疫組織化學(xué)IOD值比較（n=20，±s）

表1　各組小鼠24 h免疫組織化學(xué)IOD值比較（n=20，±s）

注：1）與同期對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與同期IR模型組比較，P＜0.05

組別　MCP1（×103）對(duì)照組　1.82±0.02 IR模型組　7.62±0.131）Dex組　3.87±0.052）HIF-1α（×103）0.15±0.03 0.75±0.121）0.41±0.062）

圖7　各組小鼠腎組織HIF-1α蛋白表達(dá)

圖8　各組小鼠腎組織HIF-1α蛋白表達(dá)比較

表2　24 h后3組小鼠血肌酐及尿素氮比較（n=20，±s）

表2　24 h后3組小鼠血肌酐及尿素氮比較（n=20，±s）

注：1）與同期對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與同期IR模型組比較，P＜0.05

組別　BUN/（mmol/L）對(duì)照組　6.26±0.34 IR模型組　23.39±4.151）Dex組　18.33±4.071）2）Scr/（μmol/L）30.62±2.55 78.34±5.171）54.09±3.271）2）

3　討論

腎臟缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的過程，休克、體外循環(huán)術(shù)后、圍產(chǎn)期窒息等過程常發(fā)生腎缺血性損傷，嚴(yán)重者將導(dǎo)致急性腎功能衰竭的發(fā)生，也是患者入住ICU的主要原因。腎IR損傷病變的本質(zhì)包括腎小管可逆性非致死性功能障礙和致死性損傷［5］。近年來，研究認(rèn)為，凋亡和炎癥反應(yīng)在腎IRI的病理生理過程中占有核心地位［6］。HUANG等［7］認(rèn)為，炎癥反應(yīng)是IRI最為主要的特征之一。而劇烈的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致急性腎小管壞死，壞死后的小管碎屑作為一種危險(xiǎn)信號(hào)在循環(huán)中進(jìn)一步激發(fā)炎癥反應(yīng)，使腎小管上皮細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)。因此，針對(duì)急性腎損傷的早期抗炎治療具有重要的價(jià)值［8］。

Dex是新一代α2AR激動(dòng)劑，分布半衰期為約5 min，消除半衰期約2 h，不良反應(yīng)相對(duì)輕且少。臨床上主要作為手術(shù)麻醉輔助藥和ICU鎮(zhèn)靜。此外，Dex還具有鎮(zhèn)痛、抑制交感興奮、抗焦慮、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)和利尿效應(yīng)［3］。BILLINGS等［9］研究發(fā)現(xiàn)，Dex可以維持小鼠腎髓質(zhì)血流從而防止造影劑腎病發(fā)生。KOCOGLU等［2］在腎缺血再灌注損傷大鼠研究中發(fā)現(xiàn)，Dex預(yù)處理可降低腎缺血再灌注損傷，提高腎臟對(duì)缺血的耐受性。因此，筆者推測(cè)，Dex能夠通過減輕腎損傷后炎癥反應(yīng)、阻止腎小管上皮細(xì)胞凋亡加劇從而降低缺血再灌注后腎損傷的程度。

本實(shí)驗(yàn)通過HE染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，而IR模型組出現(xiàn)不同程度的腎小管擴(kuò)張、萎縮、空泡變性，腎小管上皮細(xì)胞扁平、核染色缺失、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。但Dex組小鼠腎臟組織病理改變較IR模型組明顯減輕。說明Dex本身對(duì)腎臟不會(huì)造成損傷，Dex能夠減輕IR后受損腎臟的病變程度，從一定程度上維持腎臟結(jié)構(gòu)與形態(tài)的穩(wěn)定，進(jìn)而改善腎臟功能。

HIF-1α是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異性轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞低氧的可靠標(biāo)記物，是反映低氧狀態(tài)的一個(gè)敏感指標(biāo)［10］。HAUCK等［11］認(rèn)為，缺氧導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要方式是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞內(nèi)氧濃度對(duì)HIF-1α的表達(dá)進(jìn)行著精細(xì)的調(diào)節(jié)，隨著氧濃度的下降，其表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組HIF-1α表達(dá)較微弱，IR模型組HIF-1α大量表達(dá)，而Dex組HIF-1α較IR模型組表達(dá)顯著減少。說明Dex能夠減輕腎IR后受損腎小管上皮細(xì)胞低氧狀態(tài)，從而減輕腎臟損害。

MCP1是趨化因子CC亞家族中的一員，在正常情況下腎組織中僅有少量表達(dá)。然而，在病理狀態(tài)下，MCP1在腎小管間質(zhì)中可廣泛表達(dá)。劉雷等［5］認(rèn)為，MCP1啟動(dòng)并放大炎癥反應(yīng)過程，在腎IRI中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組MCP1表達(dá)較微弱，IR模型組MCP1大量表達(dá)，而Dex組MCP1蛋白表達(dá)水平較IR模型組顯著減少。說明Dex能夠通過減輕IR后腎組織炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)腎臟功能。從表2可以看出，Dex組小鼠腎功能較IR模型組明顯改善。

IR的炎癥反應(yīng)始于缺血階段，再灌注之后補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，引發(fā)后天免疫系統(tǒng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)炎癥的發(fā)展［8］，炎癥反應(yīng)的發(fā)展可能會(huì)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)加劇。因此，針對(duì)ARF/AKI的早期抗炎治療具有重要的價(jià)值。通過以上研究結(jié)果，筆者推測(cè)Dex參與腎臟IRI后的病理生理過程，主要通過下調(diào)MCP1和HIF-1α的表達(dá)，從而減輕腎臟炎癥反應(yīng)，降低腎小管上皮細(xì)胞缺氧程度，進(jìn)而保護(hù)腎臟功能。希望能夠?yàn)榕R床早期防治IR后腎損傷及其他臟器損傷提供新的治療思路。

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（張蕾編輯）

論著

Protective effect of Dexmedetomidin on kidney injury induced by renal ischemia-reperfusion and its mechanism

Lin Bu1，Yan Chen2
（1. Intensive Care Unit，2. Department of Nephrology，the Affiliated Hospital，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu 221003，China）

Abstract：Objective To establish a mouse model of ischemia-reperfusion injury（IRI）and to investigate the protective effects of Dexmedetomidine（Dex）injection on renal tubules，so as to provide new available methods for acute kidney injury（AKI）. Methods Sixty female mice were randomly divided into three groups∶control group，renal IRI group and Dex group，with 20 mice in each group. The mice were sacrificed at the 24th hour after surgery，then the bilateral kidneys and blood samples were collected. The blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（Scr）were measured by automatic biochemistry analyzer. HE staining was used to observe the pathology of the kidneys. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α）and monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）. Results There was no significant changes of renal tubules in the control group. In the renal IRI group，renal tubular epithelial cells were obviously damaged，and their expressions of HIF-1α and MCP-1 noticeably increased. However，renal tubular injury in the Dex group was lighter than that of the IR group；the expressions of HIF-1α and MCP-1，the hypoxia degree and inflammatory reaction of renal tubules as well as the levels of BUN and Scr of the Dex group were lower than those of the IR group. Conclusions It maybook=2,ebook=7be naturally speculated that Dex can protect renal function through reducing inflammatory reaction and hypoxia degree of damaged renal tubular epithelial cells following renal IR.

Keywords：ischemia-reperfusion；tubular epithelial cell；Dexmedetomidin

中圖分類號(hào)：R692；R-332

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.001

文章編號(hào)：1005-8982（2016）10-0001-05

收稿日期：2015-11-23