于秋紅，郁軍超，吉康祥，劉亞玲，薛連璧

?

大劑量高壓氧對腦梗死大鼠細胞色素C及caspase-3的影響

于秋紅，郁軍超，吉康祥，劉亞玲，薛連璧

［摘要］目的觀察單次高壓氧（HBO）治療9 h對永久性大腦中動脈阻塞（MCAO）大鼠細胞色素C和caspase-3水平的影響。方法48只Sprague-Dawley大鼠制作永久性MCAO模型，分為對照組（n=24）和高壓氧組（n=24），高壓氧組大鼠于造模成功后3 h予單次高壓氧治療9 h，壓力0.2 MPa。于造模成功后3 h、13 h、24 h行大鼠Garcia神經(jīng)功能評分，于造模成功后13 h、24 h TUNEL法檢測大鼠腦組織細胞凋亡數(shù)，ELISA法檢測缺血半暗帶腦組織細胞色素C及活性caspase-3水平。結(jié)果兩組大鼠造模成功后13 h、24 h神經(jīng)功能均有明顯改善，兩組間無顯著性差異（t＜2.07，P＞0.05）。兩組造模成功后13 h、24 h均見凋亡細胞，高壓氧組明顯少于對照組（t＞6.57，P＜0.01）。高壓氧組細胞色素C和caspase-3的水平在造模成功后24 h低于對照組（t＞2.41，P＜0.05）。結(jié)論大劑量高壓氧超早期治療可降低腦缺血后細胞色素C和caspase-3水平，減少細胞凋亡，可能是高壓氧治療腦梗死的機制之一。

［關(guān)鍵詞］腦梗死；高壓氧；細胞色素C；caspase-3；凋亡；大鼠

［本文著錄格式］于秋紅，郁軍超，吉康祥，等.大劑量高壓氧對腦梗死大鼠細胞色素C及caspase-3的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（5）:540-543.

作者單位：首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院高壓氧科，北京市100050。

腦梗死的治療策略主要是盡快恢復缺血區(qū)域的血流和給予神經(jīng)保護治療［1］。有研究提示，高壓氧（hyperbaric oxygenation，HBO）治療能促進腦新生血管的形成和側(cè)支循環(huán)的建立［2-3］，且有直接神經(jīng)保護作用［4］，能保護缺血半暗帶可存活腦細胞［5］。我們前期實驗提示，大劑量高壓氧超早期治療永久性大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠，可能通過提高內(nèi)源性血管內(nèi)皮生長因子（vascular endo-thelial growth factor，VEGF），促進側(cè)支循環(huán)建立，減小腦梗死體積，從而抑制、阻斷，甚至逆轉(zhuǎn)腦缺血后病理變化［6］。高壓氧治療可通過抑制腦梗死大鼠線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）降低，減少細胞凋亡［7］。我們采用高壓氧單次9 h方案，超早期治療局部腦梗死大鼠，觀察高壓氧對大鼠凋亡相關(guān)分子細胞色素C和caspase-3水平的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體質(zhì)量（280±20）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。術(shù)前大鼠禁食不禁水3 h以上。

1.2試劑

水合氯醛、蔗糖：北京化學試劑公司。多聚甲醛（Cat#KGT558）、磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS，Cat#KGT549）、檸檬酸鈉（Cat#KGT553）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，Cat#KGT551）、TUNEL試劑盒（Cat#KGA7044，含緩沖液、熒光素標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶、抗熒光素抗體、辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺顯色劑）、線粒體/細胞核提取試劑盒（Cat#KGA828）：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。大鼠細胞色素C ELISA試劑盒、大鼠caspase-3 ELISA試劑盒：美國RB公司。

1.3模型制作及分組

采用改良Longa線栓法［8］永久性阻塞大鼠左側(cè)大腦中動脈。術(shù)后3 h采用姿勢反射試驗進行行為學評分（3分制）［9］，評分≥1分的動物視為造模成功，排除麻醉未清醒、死亡、無自主行動大鼠和無神經(jīng)功能缺損大鼠。造模成功的大鼠分為對照組（n=24）和高壓氧組（n=24）。

1.4方法

高壓氧組動物于MCAO后3 h開始高壓氧治療。采用透明純氧動物實驗艙（上海減壓器廠），壓力0.2 MPa，升壓20 min，穩(wěn)壓9 h，減壓40 min。為避免氧中毒，大鼠于第1、3、5、7、9小時呼吸純氧，第2、4、6、8小時呼吸高壓空氣。對照組MCAO后呼吸常壓空氣。

1.5觀察指標

1.5.1神經(jīng)功能評分

采用Garcia評分［10］于MCAO后3 h、13 h、24 h對大鼠進行行為學評分。

1.5.2TUNEL染色

于MCAO后13 h、24 h，每組取6只大鼠10A水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，生理鹽水、4A甲醛灌殺，取前囟后3～6 mm處腦組織冰凍切片，厚20 μm，TUNEL染色。冰凍切片浸入通透液，冰上促滲2 min，PBS沖洗3次，滴加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶反應液，濕盒中37℃反應60 min，PBS沖洗3次。熒光顯微鏡觀察，每只大鼠選5個視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，取平均數(shù)。

1.5.3ELISA染色

于MCAO后13 h、24 h，每組取6只大鼠，斷頭取腦，將缺血半暗帶腦組織［11］剪成糊糜，使用線粒體/細胞核提取試劑盒，全程低溫操作，漂洗、研磨、多次離心制成胞漿提取液，采用細胞色素C和caspase-3 ELISA試劑盒，按說明書步驟操作，檢測細胞色素C 和caspase-3含量。

1.6統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料符合正態(tài)分布，以表示，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1神經(jīng)功能評分

與MCAO后3 h相比，各組大鼠13 h時評分明顯增加（P＜0.01），但24 h時沒有進一步的改善。高壓氧組評分較對照組雖有提高的趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

2.2凋亡細胞數(shù)

兩組大鼠缺血半暗帶區(qū)可見大量凋亡細胞，高壓氧組較對照組明顯減少（P＜0.01），高壓氧組24 h較13 h時凋亡細胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）。見表2。

2.3細胞色素C

細胞色素C在MCAO后13 h可見，兩組水平相近。24 h時，對照組細胞色素C水平繼續(xù)增高，而高壓氧組有下降趨勢，較對照組明顯降低。見表3。

2.4caspase-3

對照組caspase-3水平在13 h增高（正常時胞漿內(nèi)水平為0），在24 h仍處于高位水平，而高壓氧組caspase-3水平在24 h下降，較13 h及對照組皆降低。見表4。

表1　各組大鼠Garcia評分比較

表2　各組TUNEL陽性細胞計數(shù)比較

表3　各組細胞色素C水平比較（pg/ml）

表4　各組caspase-3水平比較（μmol/ml）

3　討論

高壓氧治療MCAO模型的療效存在爭議［12-14］，高壓氧治療開始的時間和劑量是關(guān)鍵［15］。本研究和前期結(jié)果［6-7，16］類似，顯示單次9 h高壓氧能改善局部腦梗死大鼠的神經(jīng)功能，減少細胞凋亡。原因可能是缺血周圍區(qū)存在部分休眠細胞，高壓氧提供充足的氧氣，挽救部分休眠細胞，并使不可挽救的細胞發(fā)生凋亡而非壞死，避免梗死進一步擴大，從而改善神經(jīng)功能。

細胞色素C是第一種被發(fā)現(xiàn)的與線粒體有關(guān)的促凋亡因子。本研究顯示，腦缺血后凋亡細胞、細胞色素C和caspase-3出現(xiàn)；大劑量高壓氧治療后，缺血半暗帶區(qū)凋亡細胞減少，作用可持續(xù)到缺血后24 h；這一過程伴有細胞色素C和caspase-3水平降低。其機制可能是高壓氧穩(wěn)定了線粒體膜電位［7］，不僅提供充足ATP［17-19］，而且抑制缺血后細胞色素C等凋亡相關(guān)物質(zhì)釋放［20］，從而減少內(nèi)源性凋亡途徑激活［21］。

大鼠在體研究證實，高壓氧通過線粒體途徑引起外周血淋巴細胞凋亡，抑制早期急性胰腺炎的炎性反應［22］。機制包括凋亡誘導因子［23］轉(zhuǎn)位、神經(jīng)蛋白［24］等。我們此前的研究也證實，高壓氧可通過線粒體途徑影響細胞凋亡［7］。體外研究發(fā)現(xiàn)，30 min高壓氧暴露可通過線粒體機制導致T淋巴細胞凋亡［25］。當然，高壓氧也可通過非線粒體途徑影響細胞凋亡。

本研究尚存以下局限。首先是觀察時點較少，觀察時間較短，可能不足以反映腦梗死過程中各指標演變的完整過程；其次，由于缺血半暗帶是一個動態(tài)變化的區(qū)域，取材定位的缺血半暗帶與實際的缺血半暗帶可能存在差距。

［參考文獻］

［1］Griessenauer CJ，F(xiàn)oreman P，Deveikis JP，et al.Endovascular tools available for the treatment of cerebrovascular disease［J］. Neurosurg Clin NAm，2014，25（3）:387-394.

［2］Peng ZR，Yang AL，Yang QD.The effect of hyperbaric oxygen on intracephalic angiogenesis in rats with intracerebral hemorrhage［J］.J Neurol Sci，2014，342（1-2）:114-123.

［3］Duan S，Shao G，Yu L，et al.Angiogenesis contributes to the neuroprotection induced by hyperbaric oxygen preconditioningagainst focal cerebral ischemia in rats［J］.Int J Neurosci，2015，125（8）:625-634.

［4］Matchett GA，Martin RD，Zhang JH.Hyperbaric oxygen therapy and cerebral ischemia:neuroprotective mechanisms［J］. Neurol Res，2009，31（2）:114-121.

［5］Li JS，Zhang W，Kang ZM，et al.Hyperbaric oxygen preconditioning reduces ischemia-reperfusion injury by inhibition of apoptosis via mitochondrial pathway in rat brain［J］.Neuroscience，2009，159（4）:1309-1315.

［6］于秋紅，張紅霞，劉亞玲，等.單次9小時高壓氧超早期治療對大鼠腦梗死體積的影響［J］.中國卒中雜志，2008，3（9）: 662-666.

［7］于秋紅，李婕，劉亞玲，等.大劑量高壓氧超早期治療對局部腦梗死大鼠細胞凋亡的影響［J］.中國卒中雜志，2014，9（9）: 762-766.

［8］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without cranitonomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）:84-91.

［9］Zhang L，Schallert T，Zhang ZG，et al.A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia［J］.J Neurosci Method，2002，117（2）: 207-214.

［10］Garcia JH，Wagner S，Liu KF，et al.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.Statistical validation［J］.Stroke，1995，26 （4）:627-635.

［11］Ashwal S，Tone B，Tian HR，et al.Core and penumbral nitric oxide synthase activity during cerebral ischemia and reperfusion［J］.Stroke，1998，29（5）:1037-1047.

［12］李綱，張志強，張立新.即時高壓氧對大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的影響［J］.中國康復理論與實踐，2015，21（1）:39-41.

［13］Rusyniak DE，Kirk MA，May JD，et al.Hyperbaric oxygen therapy in acute ischemic stroke:results of the Hyperbaric Oxygen in Acute Ischemic Stroke Trial Pilot Study［J］.Stroke，2003，34（2）:571-574.

［14］Lu Y，Kang J，Bai Y，et al.Hyperbaric oxygen enlarges the area of brain damage in MCAO rats by blocking autophagy via ERK1/2 activation［J］.Eur J Pharmacol，2014，728:93-99.

［15］王曉紅，黃禮群，龔琴，等.不同時間窗及療程的高壓氧治療對急性腦梗死的影響［J］.重慶醫(yī)學，2011，40（31）:3140-3142.

［16］于秋紅，劉亞玲，吳雅麗，等.單次9h高壓氧超早期治療局部腦梗死大鼠療效探討［J］.山東醫(yī)藥，2008，48（37）:36-38.

［17］Nicotera P，Leist M，F(xiàn)errando-May E.Intracellular ATP，a switch in the decision between apoptosis and necrosis［J］.Toxicol Lett，1998，102-103:139-142.

［18］Zhou SH，Sun YF，Wang G.Effects of hyperbaric oxygen on intestinal mucosa apoptosis caused by ischemia-reperfusion injury in rats［J］.World J Emerg Med，2012，3（2）:135-140.

［19］Sun L，Strelow H，Mies G，et al.Oxygen therapy improves energy metabolism in focal cerebral ischemia［J］.Brain Res，2011，1415:103-108.

［20］Wang L，Li W，Kang Z，et al.Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates early apoptosis after spinal cord ischemia in rats［J］.J Neurotrauma，2009，26（1）:55-66.

［21］Xu S，Liu J，Zhang Y，et al.Apoptosis-related protein expression in rabbits with blast brain injury following early hyperbaric oxygen therapy［J］.Neural Regen Res，2012，7（17）: 1318-1324.

［22］Bai X，Song Z，Zhou Y，et al.The apoptosis of peripheral blood lymphocytes promoted by hyperbaric oxygen treatment contributes to attenuate the severity of early stage acute pancreatitis in rats［J］.Apoptosis，2014，19（1）:58-75.

［23］Li H，Chen G，Ma W，et al.Water-soluble coenzyme q10 inhibits nuclear translocation of apoptosis inducing factor and cell death caused by mitochondrial complex I inhibition［J］.Int J Mol Sci，2014，15（8）:13388-13400.

［24］Liu J，Yu Z，Guo S，et al.Effects of neuroglobin overexpression on mitochondrial function and oxidative stress following hypoxia/reoxygenation in cultured neurons［J］.J Neurosci Res，2009，87（1）:164-170.

［25］Weber SU，Koch A，Kankeleit J，et al.Hyperbaric oxygen induces apoptosis via a mitochondrial mechanism［J］.Apoptosis，2009，14（1）:97-107.

·綜述·

CITED AS:Yu QH，Yu JC，Ji KX，et al.Effect of intensive hyperbaric oxygenation on cytochrome C and caspase-3 in rats after focal cerebral infarction［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（5）:540-543.

Effect of Intensive Hyperbaric Oxygenation on Cytochrome C and Caspase-3 in Rats after Focal Cerebral Infarction

YU Qiu-hong，YU Jun-chao，JI Kang-xiang，LIU Ya-ling，XUE Lian-bi
Department of Hyperbaric Oxygen，Beijing Tiantan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China

Correspondence to XUE Lian-bi.E-mail:xue40@vip.sina.com

Abstract：Objective To observe the effect of single intensive hyperbaric oxygenation（HBO）on cytochrome C and caspase-3 in rats after permanent middle cerebral artery occlusion（MCAO）very early.Methods Forty-eight male Sprague-Dawley rats were subjected to permanent MCAO model using the intraluminal suture method，and were divided into control group（n=24）and HBO group（n=24）.The HBO group stayed in the hyperbaric cabin with a pressure of 0.2 MPa for 9 hours 3 hours after MCAO.They were measured with Garcia scores 3 hours，13 hours and 24 hours after MCAO.Apoptosis cells of ischemic penumbra tissue were investigated with TUNEL 13 hours and 24 hours after MCAO，while the level of cytochrome C and caspase-3 were measured with ELISA.Results The Garcia scores increased 13 hours and 24 hours after MCAO in both groups，but there was no significant difference between groups（t＜2.07，P＞0.05）.The apoptosis cells were found in both groups 13 hours and 24 hours after MCAO，and less in the HBO group than in the control group（t＞6.57，P＜0.01）. The levels of cytochrome C and caspase-3 were less in the HBO group than in the control group 24 hours after MCAO（t＞2.41，P＜0.05）. Conclusion A single intensive HBO in very early stage may improve neurological function after cerebral ischemia in rats，which may associate with the inhibition of cytochrome C and caspase-3 to reduce cell apoptosis.

Key words:cerebral infarction；hyperbaric oxygen；cytochrome C；caspase-3；apoptosis；rats

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.05.011

［中圖分類號］R743.32

［文獻標識碼］A

［文章編號］1006-9771（2016）05-0540-04

作者簡介：于秋紅（1977-），女，漢族，河北遷西縣人，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：高壓氧神經(jīng)病學，神經(jīng)系統(tǒng)疾病的早期治療和康復。通訊作者：薛連璧，男，博士，主任醫(yī)師。E-mail:xue40@vip.sina. com。

收稿日期：（2015-10-12修回日期：2016-03-03）