李樹義　鮑承賢　董雪松　河北省唐山市第九醫(yī)院(唐山063000)

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·實驗研究·

百合固金湯合生脈散加減方對肺結(jié)核模型大鼠肺組織MIF、TNF-α蛋白表達的影響*

李樹義鮑承賢董雪松△河北省唐山市第九醫(yī)院(唐山063000)

摘要目的：觀察百合固金湯合生脈散加減方對肺結(jié)核模型大鼠肺組織MIF、TNF-α蛋白表達的影響。方法：將昆鼠制備肺結(jié)核模型，隨機分為模型組、對照組和實驗組，每組30 只。感染第 2 天開始，模型組每日灌胃生理鹽水6mL/kg，連續(xù)灌胃3個月；對照組用利福平濃度3g/mL，6 mL/kg進行灌胃治療 ；實驗組應(yīng)用百合固金湯合生脈散加減方，濃度3g/mL，6 mL/kg進行灌胃治療，觀察3個月。檢測周圍血T細(xì)胞亞群的變化和肺結(jié)核結(jié)節(jié)組織MIF、TNF-α蛋白表達變化。結(jié)果：對照組和實驗組與模型組比較，周圍血T細(xì)胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%有明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組和實驗組與模型組比較，肺結(jié)核結(jié)節(jié)中MIF蛋白含量有明顯降低，差異性有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組和實驗組與模型組比較，肺結(jié)核結(jié)節(jié)中TNF-α蛋白含量有明顯降低，差異性有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組與對照組比較，TNF-α蛋白含量有所降低，差異性有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)結(jié)論：百合固金湯合生脈散加減方可有效提高周圍血T細(xì)胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%，減低肺結(jié)核結(jié)節(jié)組織MIF、TNF-α蛋白含量。

主題詞結(jié)核,肺/中醫(yī)藥療法百合固金湯/治療應(yīng)用生脈散/治療應(yīng)用動物實驗大鼠

肺結(jié)核是一種肺部感染性疾病，祖國醫(yī)學(xué)在防治此疾病具有獨特的優(yōu)勢，本研究應(yīng)用百合固金湯合生脈散加減方對肺結(jié)核鼠模型進行干預(yù)，觀察肺結(jié)核結(jié)節(jié)組織MIF、TNF-α蛋白表達及周圍血T細(xì)胞亞群的變化，來探究此中藥復(fù)方在防治肺結(jié)核作用機制。

1材料與方法1.1 實驗動物昆明種小鼠90只,雌雄各半,體重(20±5) g,清潔級,購于購于北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實驗動物中心溫度、濕度、通風(fēng)良好。

1.2試劑與儀器百合固金湯合生脈散加減方(百合、熟地、生地、當(dāng)歸、白芍等)； 結(jié)核分支桿菌 H37Rv 購于中國藥品與生物制品鑒定所；利福平膠囊購自廣東金葫蘆制藥有限公司，批號 2013546；沈陽萬類生物科技有限公司夠置以下產(chǎn)品：BCA蛋白定量試劑盒；Western Blot一抗二抗去除液(強堿性)；Western及IP細(xì)胞裂解SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒；DAB顯色試劑盒(20x)；巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體。低溫高速離心機(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司);GeIDocTMXR+成像系統(tǒng)(Bio-Rad )；多功能電泳儀(北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)。

1.3方法1.3.1 分組與模型制備:常規(guī)喂養(yǎng)1周后隨機數(shù)字隨機分為3組: 模型組、對照組和實驗組，每組30只。按照參考文獻[1]鼠尾靜脈注射5 mg/mL的結(jié)核桿菌懸液0.2mL，形成肺結(jié)核動物模型。

1.3.2 處理方法:感染第 2 天開始，模型組每日灌胃生理鹽水6mL/kg，連續(xù)灌胃3個月；對照組用利福平濃度3g/mL，6mL/kg進行灌胃治療 ；實驗組應(yīng)用百合固金湯合生脈散加減方，濃度3g/mL，6 mL/kg進行灌胃治療，觀察3個月。

1.4觀察指標(biāo)及方法1.4.1周圍血T細(xì)胞亞群的變化:采集眼靜脈血2mL，分離低溫保存。采用MCAB-A-E花樣環(huán)法,按常規(guī)操作[2]。

1.4.2 肺結(jié)核結(jié)節(jié)組織MIF、TNF-α蛋白表達的檢測:將肺結(jié)核結(jié)節(jié)組織細(xì)胞裂解，離心提取組織總蛋白，取蛋白，上樣到10%/15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳、電轉(zhuǎn)，將硝酸纖維素膜(NC)孵育兔來源 MIF、TNF-α第一抗體，4℃過夜。DBS液清洗，孵育山羊抗兔第二抗體，CL 染色，膠片顯影、定影。膠片掃描后，使用 Image J 軟件處理條帶灰度值。

2結(jié)果2.13組周圍血T細(xì)胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%的變化對照組和實驗組與模型組比較，周圍血T細(xì)胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%有明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 對照組與實驗組比較，差異性無有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1　周圍血T細(xì)胞亞群的變化±s )

注：與模型組比較，?P<0.05

2.2三組肺結(jié)核結(jié)節(jié)MIF、TNF-α蛋白含量變化 對照組和實驗組與模型組比較，肺結(jié)核結(jié)節(jié)中MIF蛋白含量有明顯降低，差異性有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組和實驗組與模型組比較，肺結(jié)核結(jié)節(jié)中TNF-α蛋白含量有明顯降低，差異性有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組與對照組比較，TNF-α蛋白含量有所降低，差異性有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　三組肺結(jié)核結(jié)節(jié)MIF、TNF-α/β-actin 比值

注：與模型組比較，?P<0.05；與對照組比較，▲P<0.05

3討論細(xì)胞免疫功能低下可誘發(fā)肺結(jié)核發(fā)病[3-4]，MIF對于抵抗胞內(nèi)病原微生物具有先天的免疫作用，TNF-α也直接參與結(jié)核病的免疫應(yīng)答，它們是參與肺結(jié)核免疫應(yīng)答及免疫發(fā)病過程的重要細(xì)胞因子[5-6]。研究顯示MIF、TNF-α在肺結(jié)核結(jié)節(jié)中的出現(xiàn)高表達，并且成正相關(guān)。兩者在肺結(jié)核結(jié)節(jié)中可能互相誘導(dǎo)、刺激,放大炎性反應(yīng)，MIF抑制巨噬細(xì)胞游走,促進其在炎癥局部浸潤、激活、增生并分泌炎性細(xì)胞因子，激發(fā)結(jié)核分枝桿菌的作用[7]。

中醫(yī)藥在防治肺結(jié)核發(fā)揮著越來越重要的作用，其中本研究中應(yīng)用的百合固金湯合生脈散加減方依據(jù)與肺結(jié)核病理特點配伍組成，具有潤肺生津，清熱化痰止咳等作用。研究表明：百合固金湯合生脈散加減方可有效提高周圍血T細(xì)胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%，減低肺結(jié)核結(jié)節(jié)組織MIF、TNF-α蛋白含量加強免疫應(yīng)答，進而控制慢性感染。

參考文獻

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(收稿2015-10-09;修回2015-11-13)

【中圖分類號】R256.17

【文獻標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.02.047

通訊作者：? 唐山市第四醫(yī)院 (唐山063000)

*國家自然基金資助項目(81303046)

河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(2015163)