胡宗苗　周春梅　劉繼平　張恩戶　陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實驗室(咸陽712046)

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可降解止血粉對家兔顱骨愈合的影響*

胡宗苗周春梅劉繼平張恩戶△陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實驗室(咸陽712046)

摘要目的：研究可降解止血粉對家兔顱骨愈合的影響。方法：取新西蘭兔，麻醉后在顱骨同一位置處用骨鉆鉆2個圓形缺損孔洞，造成骨缺損模型，造模成功后，隨機分成空白組、可降解止血粉組及骨蠟組。除空白組外其余兩組分別給予50mg相同劑量的可降解止血粉、骨蠟完全覆蓋。分別于處死動物前間隔7d耳緣靜脈注射鈣黃綠素和四環(huán)素做兩次標(biāo)記，6周后處死，取原缺損邊緣擴展2.0cm范圍的顱骨，進(jìn)行骨質(zhì)愈合情況評分，然后制作不脫鈣骨切片，行組織病理學(xué)及熒光觀察。結(jié)果：可降解止血粉組骨愈合效果明顯優(yōu)于空白對照組 (P<0.05)，骨蠟組明顯差于空白對照組(P<0.05)。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，可降解止血粉組礦物質(zhì)沉積速度明顯高于空白對照組 (P<0.05)，骨蠟組明顯低于空白對照組(P<0.05)；可降解止血粉組骨小梁面積比和礦化骨面積率較大，空白對照組次之，骨蠟組最小，而缺損面積比大小與骨小梁面積比呈現(xiàn)相反趨勢，各組比較均有顯著性差異。結(jié)論：可降解止血粉能促進(jìn)顱骨愈合，而骨蠟則阻礙骨質(zhì)生長。

主題詞 顱骨骨折愈合/中醫(yī)藥療法動物實驗兔

骨折愈合是指骨折斷端再連接的自然修復(fù)過程。促進(jìn)骨折愈合是指應(yīng)用藥物或某些方法作用于局部或全身，使骨折后的骨組織修復(fù)能力增強、速度加快的過程。顱骨骨折和缺損是外傷及神經(jīng)外科手術(shù)中經(jīng)常面臨的問題，促進(jìn)修復(fù)愈合具有十分重要的臨床意義，目前在此方面尚無較好的措施和手段。中醫(yī)認(rèn)為骨折最基本的病理變化是氣滯血瘀，而使用中藥促進(jìn)骨折愈合被認(rèn)為是一個瘀去、新生、骨合的過程，在治療上一般早期使用活血藥以祛瘀生新；然后用接骨續(xù)筋藥促進(jìn)愈合；最后則用補益藥增強肝腎功能，加速愈合。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及新型醫(yī)用材料的研究與開發(fā)，對中藥有效部位及有效成分的研究日益增多[1-2]?？山到庵寡?Absorbable hemostatic powder)是一種從植物中提取的多糖高分子聚合物，臨床使用發(fā)現(xiàn)其具有加速創(chuàng)面愈合的作用，但缺乏這方面的基礎(chǔ)研究。本課題組以家兔顱骨損傷模型為實驗對象，對可降解止血粉促進(jìn)顱骨愈合作用進(jìn)行評價，為其進(jìn)一步開發(fā)臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料 1.1實驗動物雌性新西蘭兔24只，清潔級，體重2kg左右，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK-(軍)2012-0007。飼養(yǎng)環(huán)境：陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實驗室，動物分籠飼養(yǎng)，保持12h晝夜節(jié)律，室溫為(22±1)℃，自由飲水?dāng)z食。

1.2藥品與試劑可降解止血粉購自青島頤中生物工程有限公司，批號1403008；骨蠟購自上海強生醫(yī)療器材有限公司，生產(chǎn)批號HL5BDPM；戊巴比妥鈉，德國默克醫(yī)藥生物科技公司，批號140418；硫酸慶大霉素注射液，辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號1412182211。

1.3 儀器Leica 1600型硬組織切片機，德國LEICA公司；熒光顯微鏡，日本OLYMPUS公司；普通顯微鏡，廈門MOTIC公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司等。

2方法2.1造模與分組雌性新西蘭兔適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，每只動物分別耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，俯臥固定于手術(shù)臺上，手術(shù)暴露顱骨，剝開骨外膜，以直徑6mm鉆頭在顱骨中縫兩側(cè)距離1.5cm的位置處鉆出2個圓形缺損孔洞，造成骨缺損模型[3]。造模成功后，隨機分成空白組、可降解止血粉組及骨蠟組，每組8只。除空白組外其余兩組分別給予50mg相同劑量的可降解止血粉、骨蠟完全覆蓋，逐層縫合，術(shù)后連續(xù) 3d肌肉注射慶大霉素預(yù)防感染。分別于處死前7d耳緣靜脈注射鈣黃綠素(2%的碳酸氫鈉溶解)20mg/kg；處死前1天另一側(cè)耳緣靜脈注射四環(huán)素(雙蒸水溶解)30mg/kg[4]，6周后處死。

2.2取材與標(biāo)本處理動物處死后取原缺損邊緣擴展2.0cm范圍的顱骨，大體觀察進(jìn)行骨愈合評分，制作不脫鈣骨切片，行組織病理學(xué)及熒光觀察。

2.2.1缺損處骨愈合評分標(biāo)準(zhǔn)：見表1。

表1　 骨質(zhì)愈合評分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.2礦物質(zhì)沉積速度(Mineral apposition rate， MAR):通過測量四環(huán)素和鈣黃綠素兩條熒光標(biāo)記線之間的距離，計算礦物質(zhì)沉積速度。計算公式：MAR=(兩次標(biāo)記熒光線距)(μm)/(兩次給藥間隔天數(shù))(d)。

2.2.3骨小梁面積比與缺如面積比:V-G染色法用來計算原缺損區(qū)域內(nèi)骨小梁的形成情況[5]。計算公式如下：骨小梁面積比=(缺損孔骨小梁面積)/(缺損孔總面積)；缺如面積比=(缺損孔缺如區(qū)域面積)/(缺損孔總面積)。

2.2.4礦化骨面積率:硝酸銀染色法用來計算原缺損區(qū)域內(nèi)礦化骨的形成情況。計算公式如下：礦化骨面積率=(缺損孔礦化骨面積)/(缺損孔總面積)。

3結(jié)果3.1缺損處骨愈合評分可降解止血粉骨愈合效果明顯優(yōu)于空白組(P<0.05)；骨蠟組骨愈合程度明顯差于空白組(P<0.05),見表2。

表2　新西蘭兔顱骨缺損孔各級別孔數(shù)

注：與空白對照組比較，?P<0.05

3.2 組織病理學(xué)3.2.1礦物質(zhì)沉積速度:可降解止血粉組礦物質(zhì)沉積速度明顯高于空白組(P<0.05)；骨蠟組明顯低于空白組(P<0.05)(見表3，圖1)。

表3　各組礦物質(zhì)沉積速度

注：與空白對照組比較,?P<0.05

表4　各組骨小梁面積比與缺如面積比±s，n=16)

注：與空白對照組比較?P<0.05

表5　各組礦化骨面積率±s)

注：與空白對照組比較,?P<0.05

3.2.2 骨小梁面積比與缺如面積比:骨小梁可以被V-G染色法染成紅色，根據(jù)染色結(jié)果計算骨小梁面積比及缺損面積比。結(jié)果顯示可降解止血粉組面積較大，空白對照組次之，骨蠟組的骨小梁面積比最小。各組值間的比較均有統(tǒng)計學(xué)差異。缺損面積比大小與骨小梁面積比大小呈現(xiàn)相反的趨勢(見表4，圖2)。

3.2.3礦化骨面積率：硝酸銀染色法可將原缺損區(qū)域內(nèi)礦化骨染成暗紅色。根據(jù)染色計算礦化骨面積。骨蠟組礦化骨面積比最小，空白對照組次之，可降解止血粉面積較大。各組值比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(見表5，圖3)。

4討論 調(diào)動人體一切積極因素參加骨與周圍組織的損傷修復(fù)過程是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對骨折愈合的認(rèn)識，主要涉及多種細(xì)胞的增殖，分化及細(xì)胞外基質(zhì)的合成與鈣化[6]。促進(jìn)骨折愈合是指應(yīng)用藥物和某些方法作用于全身或局部，使骨折后的骨組織修復(fù)能力增強的復(fù)雜生理過程，該過程又可分為為血腫機化期，原始骨痂期和骨痂改造期三個時期[7]。

近年來中藥在骨折愈合方面的機制研究不斷深入，從改善循環(huán)以消除血腫，促進(jìn)基質(zhì)膠原合成和鈣鹽沉積，提高微量元素含量并刺激骨生長因子分泌，提高成骨細(xì)胞活性和骨痂生物力學(xué)性能等多方面促進(jìn)骨折愈合。在治療方面中藥更是顯示出獨特的優(yōu)勢，尤其是外用中藥，吸收分布快，藥效迅速而直接，受體內(nèi)滅活代謝與生物轉(zhuǎn)化影響小，在促進(jìn)骨折斷端緊密靠攏、增強骨折愈合方面有其優(yōu)勢?？山到庵寡凼怯商烊恢参锾崛?，通過物化反應(yīng)制備而成的一種無菌可降解止血粉。本實驗觀察了可降解止血粉對新西蘭兔顱骨愈合的影響，結(jié)果顯示，可降解止血粉有顯著的促進(jìn)骨愈合作用。這可能是由于該藥對手術(shù)、燒燙傷和外傷創(chuàng)面發(fā)揮止血作用的同時，其獨有的氨基酸成分加速了創(chuàng)面愈合，同時其溶解后所帶的負(fù)電荷，刺激了組織細(xì)胞生長，加速了組織愈合。

綜上所述，可降解止血粉在一定程度上改善了新西蘭兔顱骨損傷的組織形態(tài)，有一定程度的加快骨折愈合的作用，具有良好的促進(jìn)骨生長的能力，可顯著促進(jìn)顱骨缺損處的修復(fù)，以上研究結(jié)果可為該藥促進(jìn)骨愈合的臨床用途提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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(收稿2015-10-07;修回2015-10-28)

Effects of Absorbable Hemostatic Powder on bone healing in rabbits Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica，Shaanxi University of

Chinese Medicine(Xianyang 712046)Hu ZongmiaoLiu JipingZhou Chunmeiet al

ABSTRACTObjective: Study on the effect of the Absorbable Hemostatic Powder on the healing of rabbit skull. Methods: After anesthesia, 2 circular defect cavities were drilled at the same location in the same position of the skull. The bone defect model and the model of the bone defect were randomly divided into two groups. The defects in each group were completely covered with the same dose of 50mg and the Absorbable Hemostatic Powder at the same dose, and the negative control group was not used in any of the materials. The rats were sacrificed respectively before the interval 7d ear vein injection of tetracycline and calcein labeled two times. After feeding for six weeks. Take the original defect edge extended range of 2.0 cm skull, gross observation of bone healing was healing score, and undecalcified bone sections, organization learning and fluorescence observation. Results: The effect of the Absorbable Hemostatic Powder group was significantly better than that the blank control group (P<0.05),and the bone wax group was significantly worse than that in the control group (P<0.05). The results showed that the rate of mineral deposition in the powder group was significantly higher than that in the blank control group (P<0.05), and the bone wax group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). Trabecular bone area rate of bone wax and mineralized bone area than the smallest group, blank control group, Absorbable Hemostatic Powder group greatly. The area ratio of the defect area and bone was the opposite trend. There were significant differences in the values of the groups. Conclusion：Absorbable Hemostatic Powder can promote bone healing, and bone wax hinder bone growth.

KEY WORDSSkull fracture healing / traditional Chinese medicine therapyAnimal experimentationRabbits

【中圖分類號】R683.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.02.049

通訊作者?

*陜西省教育廳重點科研計劃項目(15JS022)