李　允，　李　碩，　羅裕文，　陳宜泰，　黃玉霞，　王　凱，　陳　新

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院呼吸內(nèi)科, 廣東 廣州 510282)

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N-乙酰半胱氨酸聯(lián)合阿奇霉素對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氧化應激的影響*

李允，李碩，羅裕文，陳宜泰，黃玉霞，王凱，陳新△

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院呼吸內(nèi)科, 廣東 廣州 510282)

[摘要]目的： 探討N-乙酰半胱氨酸(NAC)聯(lián)合阿奇霉素(AZI)對慢性阻塞性肺疾病(COPD) 模型大鼠氧化應激的影響。方法: 將60只雄性Wistar大鼠隨機分為5組，即正常對照(control)組、模型(model)組、AZI治療組、NAC治療組和聯(lián)合治療組(AZI+NAC組)。采用煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)滴入脂多糖的方法誘導大鼠COPD模型。 NAC組和AZI組大鼠每日煙熏前30 min分別給予NAC和AZI灌胃，AZI+NAC組則給予NAC和AZI聯(lián)合灌胃。第31天行肺功能檢測后處死大鼠，提取支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行細胞計數(shù)，并采用ELISA法測定BALF中白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-17(IL-17)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。制作肺組織切片及肺勻漿，測定肺勻漿超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平。結(jié)果: 與control組對比，其余4組均出現(xiàn)肺功能的下降，組織病理提示炎癥細胞浸潤、肺泡破壞等表現(xiàn)。與control組比較，其余4組BALF中白細胞總數(shù)、單核巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞均顯著增高(P<0.05)；與model組、AZI組、NAC組比較，AZI+NAC組BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞均顯著下降(P<0.05)。與model組對比，AZI組、NAC組和AZI+NAC組IL-8、IL-17、TNF-α和MDA含量均顯著降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性均顯著增高(P<0.05)；與AZI組和NAC組比較，AZI+NAC組IL-8、IL-17、TNF-α和MDA含量均下降，SOD和GSH-Px活性均增高，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。結(jié)論: NAC和AZI均能減輕COPD模型大鼠肺部炎癥和氧化損傷，兩者聯(lián)合能增強抗氧化作用，可能更適合COPD的臨床治療。

[關鍵詞]慢性阻塞性肺疾病； N-乙酰半胱氨酸； 阿奇霉素； 氧化應激; 促炎細胞因子

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的慢性呼吸道疾病，氧化/抗氧化失衡在其發(fā)病機制中起重要作用[1-2]。因此，調(diào)節(jié)氧化應激可能改變疾病的病程，有望成為COPD治療的新靶點。目前研究發(fā)現(xiàn)，長期小劑量應用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[3-5][如阿奇霉素(azithromycin,AZI)、紅霉素等]或較大劑量的黏液溶解劑諸如N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)[6-8]均能有效減少COPD急性加重的頻率，延緩患者肺功能減退，提高患者的活動耐力及生活質(zhì)量，而其確切的作用機制尚不清楚，可能與抑制吞噬細胞(如中性粒細胞)的氧化爆發(fā)，抑制炎性細胞炎性介質(zhì)、細胞因子的釋放，增加抗氧化物的水平，糾正氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡有關。我們設想，在治療COPD時，聯(lián)合應用AZI和NAC這2種不同種類的藥物，可能發(fā)揮協(xié)同作用，增強抗炎作用和抗氧化能力，進一步提高臨床療效，但目前尚缺乏相關實驗性研究。為證實上述猜想，本實驗通過煙熏及氣道內(nèi)滴注脂多糖的方法構(gòu)建COPD大鼠模型，觀察聯(lián)合藥物干預對炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-8、IL-17以及反映氧化損傷的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的影響。

材料和方法

1材料

1.1動物雄性Wistar大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：2014-0014。飼養(yǎng)條件：每日光照12 h，常溫，健康狀況良好。將大鼠按照隨機數(shù)字表分為5組，即正常對照組(control組)、模型組(model組)、阿奇霉素治療組(AZI組)、NAC治療組(NAC組)和聯(lián)合治療組(AZI+NAC組)，每組12只。實驗過程中，model組和NAC組各死亡1只。

1.2藥物、試劑及儀器阿奇霉素(輝瑞制藥有限公司)；NAC(海南贊邦制藥有限公司)；脂多糖(河南輔仁懷慶堂制藥)；紅旗渠牌烤煙型香煙(焦油和尼古丁含量分別為每支14 mg和 1.1 mg，河南安陽卷煙廠)。TNF-α、IL-8和IL-17酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。GSH-Px測試盒、SOD試劑盒及MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。小動物肺功能測定儀(北京悅宏達責任有限公司)；自制有機玻璃熏煙箱(50 cm×50 cm×40 cm)。

2方法

2.1COPD模型的建立 大鼠放置于有機玻璃艙內(nèi)熏香煙，每天2次，每次1.5～2 h(2次間隔6 h以上)，每次點煙器中放置20根香煙，每5根香煙輪流點燃并燃燒充分。第2～13 天、15～30天連續(xù)被動吸煙，第1、14天氣管內(nèi)滴入LPS。滴入LPS的操作方法如下：將大鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于操作臺上，正中切開頸前皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露氣管，以拔除針芯的16號靜脈套管針，快速插入氣管，取溶于注射用生理鹽水的LPS(1 g/L)200 μL，通過靜脈套管針分別快速注入model組、AZI組、NAC組和AZI+NAC組大鼠氣管內(nèi)，注藥完畢后迅速將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)10 s，使藥液在肺內(nèi)分布均勻，然后拔出套管針。每日上午煙熏前30 min，NAC組給予NAC(400 mg/kg)灌胃；AZI組給予阿奇霉素(400 mg/kg)灌胃；AZI+NAC組則給予NAC和阿奇霉素聯(lián)合灌胃，直至第30天。

2.2肺功能的測定在實驗結(jié)束后次日(第31天)，測定大鼠第0.3 s用力呼氣量(forced expiratory volume in 0.3 second, FEV0.3)與用力肺活量(forced vital capacity, FVC)比值、動態(tài)順應性(dynamic compliance, Cdyn)和呼氣阻力(expiratory resistance, Re)。因FEV0.3與FEV0.3/FVC的測定需要實驗動物的配合，故采用外加壓力法迫使大鼠深呼氣和深吸氣，將大鼠仰臥位置于呼吸儀的密閉體描箱內(nèi)，描記一段平靜呼吸后，在呼氣末用注射器經(jīng)三通管迅速以相當于潮氣量的5倍量充氣(相當于深吸氣)，然后立即脫開，連接負壓(-35 cmH2O)抽氣(相當于深呼氣)，所引起的容積變化，經(jīng)微機處理后即得出各項肺功能指標。

2.3大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)提取及BALF中細胞計數(shù)、炎癥介質(zhì)測定肺功能測定結(jié)束后，處死大鼠，分離出大鼠氣管和雙肺，結(jié)扎右肺門，在氣管下段作一小T形切口，將氣管插管緩緩插入，直至抵達左主支氣管下端分叉處。用注射器吸取3 mL 0.9%氯化鈉溶液，通過導管以較小的壓力將鹽水緩慢注人肺內(nèi)，可見大鼠左肺逐漸變得膨隆、蒼白，立即緩慢回抽灌洗液，再將所得液體緩緩注回肺內(nèi)，如此反復3次，回抽出至少2 mL的BALF，盛入15 mL的塑料離心管(置于冰浴中)，此為第1次灌洗，然后重復3次上述操作(所有大鼠BALF的回收率保持在70%～80%)。所有標本計量后，離心半徑為10 cm條件下，以1 500 r/min離心10 min，取上清液置入-80 ℃冰箱中保存，使用ELISA試劑盒檢測BALF中TNF-α、IL-8和IL-17的含量，嚴格按照試劑盒的說明書進行操作。細胞用預冷Hanks液洗滌3次后，用血細胞計數(shù)板做細胞計數(shù)。

2.4病理標本制作及肺組織勻漿制備由于左肺已行肺泡灌洗，為減少灌洗可能帶來的影響，故在每只大鼠右肺不同部位取2塊組織(約1 cm×1 cm×0.5 cm)，用4%多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋，HE染色，分析肺組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)學變化，測定肺平均內(nèi)襯間隔(mean lining interval, MLI)和平均肺泡數(shù)(mean alveolar number, MAN)。每只大鼠隨機選取2張肺組織HE染色病理切片，每張切片隨機選取上、中、下、左和右5個視野(避開大血管和支氣管)，顯微鏡下(×100)觀察，在每個視野中央劃“十”字交叉線，計算與交叉線相交的肺泡間隔數(shù)(number of alveolar septum, Ns)和測量十字線的總長度(length, L)，以L/Ns即得MLI，其數(shù)值反映肺泡平均直徑；計數(shù)每個視野內(nèi)肺泡數(shù)(number of alveolar, Na)和每個視野的面積(surface area, S)，以Na/S即得MAN，其數(shù)值反映肺泡密度。此外，取右肺組織1.0 g，在預冷的生理鹽水中漂洗，用濾紙拭干，制備成10%的肺勻漿4 ℃、2 000 r/min離心10 min，收集上清液，測定SOD、GSH-Px和MDA。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1造模后肺功能變化

與control組比較，其余4組FEV0.3/FVC和Cdyn均明顯降低，Re均明顯升高(P<0.05)；與model組比較，AZI組、NAC組和AZI+NAC組FEV0.3/FVC、Cdyn和Re均有改善(P<0.05)；AZI組、NAC組和AZI+NAC組間比較無顯著差異,見表1。

表1　各組大鼠肺功能的比較

*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group.

2造模后肺組織病理改變

Control組肺泡結(jié)構(gòu)正常連續(xù)，小支氣管未見腺體及炎癥細胞浸潤，肺泡壁完整。Model組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡彈性減弱，呈囊狀擴張，肺泡腔擴大，部分融合成肺大皰；同時伴有支氣管管壁及周圍部分單核細胞和淋巴細胞浸潤。與model組相比，AZI組、NAC組和AZI+NAC組的肺泡破壞程度相對減輕，見圖1。Control組、model組、AZI組、NAC組和AZI+NAC組的MLI值(μm)依次為：40.26±5.42、81.27±9.17、63.17±7.14、60.70±8.03和51.90±8.72，其中藥物干預組MLI值均顯著低于model組，AZI+NAC組MLI值低于AZI組和NAC組(P<0.05)。4組的MAN值(mm-2)依次為：208.06±19.68、95.98±12.32、122.29±16.51、117.51±16.46和141.33±14.95，其中藥物干預組MAN值均顯著高于model組，AZI+NAC組MLI值高于AZI組和NAC組(P<0.05)。

Figure 1.Pathological changes of lung tissue in different groups (HE staining, ×100).

圖1各組大鼠肺組織病理學光鏡下觀察

3聯(lián)合用藥對BALF中細胞計數(shù)及炎癥介質(zhì)的影響

與control組比較，其余4組BALF中白細胞總數(shù)及單核巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞絕對數(shù)均顯著增高(P<0.05)；AZI組和NAC組各細胞計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學顯著性；與model組、AZI組和NAC組比較，AZI+NAC組BALF中的白細胞總數(shù)及中性粒細胞、淋巴細胞數(shù)均顯著下降，單核巨噬細胞數(shù)顯著上升(P<0.05)。與control組比較，其余4組BALF中的IL-8、IL-17和TNF-α均顯著上升(P<0.05)；與model組比較，AZI組、NAC組和AZI+NAC組上述炎癥因子均顯著降低(P<0.05)；與AZI組和NAC組比較，AZI+NAC組上述炎癥因子均顯著下降(P<0.05),見表2、3。

表2　聯(lián)合用藥對BALF中炎癥細胞的影響

*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;▲P<0.05 vs AZI group;△P<0.05 vs NAC group.

表 3　聯(lián)合用藥對BALF炎癥因子的影響

*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;▲P<0.05 vs AZI group;△P<0.05 vs NAC group.

4聯(lián)合用藥對肺勻漿中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

與control組比較，其余4組SOD和GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與model組比較，AZI組、NAC組和AZI+NAC組SOD和GSH-Px活性均顯著增高，MDA含量顯著降低(P<0.05)；AZI+NAC組SOD和GSH-Px活性均高于AZI組和NAC組，MDA含量均低于AZI組和NAC組，上述差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見表4。

表 4　聯(lián)合用藥對氧化損傷產(chǎn)物的影響

*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;▲P<0.05 vs AZI group;△P<0.05 vs NAC group.

討論

吸煙是導致COPD的重要危險因素。在實驗研究中，常常通過被動吸煙的方法建立COPD動物模型。然而，單獨使用煙熏誘發(fā)肺氣腫所需的時間較長，因此近年來更常用香煙煙熏結(jié)合LPS的造模方法。判斷COPD模型是否成功的指標，一般都用病理組織學的方法，但由于持續(xù)氣流受限是COPD的重要特征，采用病理和肺功能測定相結(jié)合的方法，可能對動物COPD模型的判斷更為準確。本研究通過參照文獻的經(jīng)典方法[9]，熏香煙加氣管注內(nèi)毒素，成功構(gòu)建了COPD大鼠模型，其病理形態(tài)學和肺功能改變均與人類COPD改變相似。

本實驗進一步探討了氧化應激在COPD發(fā)病機制中的作用。香煙中存在大量的氧化劑，活化的炎癥細胞也產(chǎn)生內(nèi)源性氧化劑，活性氧物質(zhì)生成增多將修飾脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，導致脂質(zhì)過氧化和硫醇基氧化，改變細胞膜的通透性，導致嚴重的組織損傷。MDA是一個廣泛用于脂質(zhì)過氧化的標志物，在COPD患者肺組織中也明顯升高[10]。氧化負荷增加刺激炎癥介質(zhì)表達，IL-8、IL-17、TNF-α等促炎細胞因子介導炎癥細胞在氣道局部聚集和激活，激活的炎癥細胞及細胞因子相互作用，形成復雜的細胞因子網(wǎng)絡，促進炎癥進一步發(fā)展[2]。其中IL-17在COPD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[11-13]，其與受體結(jié)合后通過MAPK、核因子κB和Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導途徑，介導中性粒細胞的募集和激活，是近年來的研究熱點。本研究顯示，煙熏和LPS誘導下，大鼠BALF中炎癥細胞、IL-8、IL-17和TNF-α含量均有升高，提示COPD發(fā)病過程中炎癥反應的增強。在促進炎癥反應的同時，機體也會啟動自我保護性調(diào)節(jié)機制，上調(diào)抗氧化物質(zhì)的表達，起到代償性防御作用。SOD和GSH-Px是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，二者對肺組織有保護作用。我們的結(jié)果也顯示，建立COPD模型后，MDA升高，SOD和GSH-Px活性下降。COPD的發(fā)病由多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)及氧化損傷參與并相互作用，中性粒細胞在氣道腔內(nèi)聚集、活化、釋放蛋白酶等多種酶類及氧自由基等，導致肺組織損傷[14]。因此，抑制肺部炎癥，增強抗氧化能力，可能減輕煙熏和LPS對COPD的損傷。

本研究通過使用阿奇霉素和N-乙酰半胱氨酸作為干預藥物，證實了2種藥物對COPD氧化應激的作用。大環(huán)內(nèi)酯類藥物除了抑菌作用外，還有獨特的免疫調(diào)節(jié)功能，其最早應用于支氣管囊性纖維化、彌漫性泛細支氣管炎的治療[15-16]，已取得了良好的臨床療效。通過大環(huán)內(nèi)酯類藥物阻斷炎癥因子的激活及其生物學效應，可能阻止COPD的發(fā)展，也是當前防治COPD的研究熱點。阿奇霉素為半合成的十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可與細菌核糖體50S亞基結(jié)合，通過中斷細菌的蛋白質(zhì)合成而阻止細菌生躍、繁殖，具有安全、有效、口服方便的優(yōu)點。目前國內(nèi)外不少研究已經(jīng)證實了阿奇霉素在穩(wěn)定期COPD患者中的作用，這可能與大環(huán)內(nèi)酯類藥物抑制中性粒細胞的氧化爆發(fā)和炎癥介質(zhì)釋放有關[17]。NAC作為抗氧化劑，分子中含有活性巰基(—SH)，可對抗不同原因所致的組織氧化損傷，在治療穩(wěn)定期COPD方面也有一定療效。本研究顯示，與造模組比較，使用阿奇霉素或N-乙酰半胱氨酸治療后IL-8、IL-17和TNF-α含量均降低，提示2種藥物均能抑制炎癥介質(zhì)的釋放；同時，SOD和GSH-Px活性提高，MDA含量出現(xiàn)降低，提示2種藥物均能增強體內(nèi)清除氧自由基的能力，減少脂質(zhì)過氧化生成的MDA，發(fā)揮對肺組織保護作用。值得注意的是，NAC為GSH的前體，能提高細胞內(nèi)谷胱甘肽生物合成，屬體內(nèi)氧自由基清除劑，從理論上來說，其抗氧化的效果要優(yōu)于阿奇霉素，但本研究顯示兩者差異尚無統(tǒng)計學顯著性，可能與灌胃生物利用度偏低、樣本量偏小等因素有關。

由上可以推測，2種藥物對COPD有抗炎作用，可能與抑制中性粒細胞聚集與活化，減少TNF-α、IL-8、IL-17等炎癥介質(zhì)的釋放有關；對COPD有抗氧化損傷作用，其機制與提高SOD和GSH-Px活性，減少MDA生成有關。研究結(jié)果顯示，N-乙酰半胱氨酸聯(lián)合阿奇霉素能顯著降低COPD模型大鼠肺部炎癥和氧化損傷的程度，較單一藥物效果更加顯著，這提示兩者聯(lián)合用于大鼠COPD治療時有協(xié)同作用，增強氧化/抗氧化平衡的調(diào)節(jié)能力，可能更適用于COPD臨床治療。但本研究為動物實驗，且樣本量偏少，兩種藥物聯(lián)合治療COPD的療程、藥物的劑量構(gòu)成有待進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects ofN-acetylcysteine combined with azithromycin on oxidative stress in rats with chronic obstructive pulmonary disease

LI Yun, LI Shuo, LUO Yu-wen, CHEN Yi-tai, HUANG Yu-xia, WANG Kai, CHEN Xin

(Department of Respiratory Medicine, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, China. E-mail: chen_xin1020@ 163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of N-acetylcysteine (NAC) combined with azithromycin (AZI) on oxidative stress in the rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). METHODS: Male Wistar rats (n=60) were randomly divided into control group, model group, AZI intervention group,NAC intervention group and AZI+NAC group. The COPD model was established by passive smoking and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Each day 30 min prior to smoking, intragastric administration with AZI, NAC or combination of the 2 drugs was given for AZI, NAC, and AZI+NAC groups, respectively. On the 31st day, all rats were killed following lung function test. Cell counts of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were performed, and the contents of interleukin-8 (IL-8), interleukin-17 (IL-17) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in BALF were measured by ELISA. The histopathology of the lung tissues was observed under light microscope, and the levels of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and malondialdehyde (MDA) in the lung homogenate were measured. RESULTS: Compared with control group, the other 4 groups showed decreased pulmonary function, and inflammatory cell infiltration and alveolar destruction in histopathology. Compared with control group, the other groups showed higher white blood cells, monocyte-macrophages, neutrophils and lymphocytes in the BALF (P<0.05). Compared with model group, AZI group and NAC group, lower white blood cells, neutrophils and lymphocytes in the BALF were observed in AZI+NAC group (P<0.05). Compared with model group, IL-8, IL-17, TNF-α and MDA in AZI group, NAC group and AZI+NAC group significantly decreased (P<0.05), while SOD and GSH-Px significantly increased (P<0.05). Compared with AZI or NAC group, IL-8, IL-17, TNF-α and MDA in AZI+NAC group significantly decreased (P<0.05), while SOD and GSH-Px increased significantly (P<0.05). CONCLUSION: Both NAC and AZI attenuate the lung inflammation and oxidative damage in COPD model rats. Combined medication exerts preferable anti-oxidation effects, which might be more suitable for the treatment of COPD.

[KEY WORDS]Chronic obstructive pulmonary disease; N-acetylcysteine; Azithromycin; Oxidative stress; Proinflammatory cytokines

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0798- 06

[收稿日期]2015- 11- 13[修回日期] 2016- 02- 04

*[基金項目]廣東省科技計劃(No. 2013B022000072)； 廣州市科技計劃(No. 201507020033)

通訊作者△Tel: 020-62782296； E-mail： chen_xin1020@163.com

[中圖分類號]R392.12

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.005

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