施益芬，　陳晶晶，　俞　康

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科， 浙江 溫州 325015)

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組蛋白化學(xué)修飾改變對(duì)c-Myb結(jié)合的影響及其在職業(yè)性苯中毒患者造血損傷中的作用*

施益芬，陳晶晶，俞康△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科， 浙江 溫州 325015)

[摘要]目的： 研究職業(yè)性苯中毒造血損傷患者中與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子c-Myb結(jié)合的組蛋白化學(xué)修飾改變, 證實(shí)組蛋白乙?；揎椝礁淖?cè)诼殬I(yè)性苯中毒造血損傷中發(fā)揮一定的作用。方法: 25例職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者為病例組，25例正常人為對(duì)照組，提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)探討與c-Myb結(jié)合的組蛋白乙?；图谆降母淖儯琑T-PCR法檢測(cè)c-Myb的mRNA表達(dá)水平，組蛋白去乙酰化酶(HDAC)試劑盒檢測(cè)HDAC活性的變化。結(jié)果: 與正常對(duì)照組相比，職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者c-Myb與乙酰化組蛋白H4、H3結(jié)合的水平下降(P<0.01), 而與甲基化組蛋白H3K4和H3K9結(jié)合的水平無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與正常對(duì)照組相比，職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者c-Myb的mRNA表達(dá)水平降低，HDAC活性明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。結(jié)論: 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子c-Myb可能通過(guò)組蛋白乙?；揎椀母淖?cè)诼殬I(yè)性苯中毒造血損傷中發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞]苯； c-Myb； 組蛋白乙?；?組蛋白甲基化； 染色質(zhì)免疫沉淀； 組蛋白去乙?；?/p>

苯是一種具有血液毒性和遺傳毒性的重要化工原料。急慢性苯中毒病例報(bào)道屢見(jiàn)不鮮。衛(wèi)生部2010年職業(yè)病防治工作和2011年重點(diǎn)工作情況通報(bào)中，苯中毒均位列慢性職業(yè)中毒前3位。對(duì)造血系統(tǒng)損害的表現(xiàn)是慢性苯中毒的主要特征，長(zhǎng)期過(guò)量接觸苯可以導(dǎo)致白細(xì)胞和血小板減少、再生障礙性貧血和白血病[1-2]。2012年，國(guó)際癌癥研究所重申苯為人類(lèi)致癌物，能導(dǎo)致急性白血病、骨髓增生異常綜合征、淋巴瘤等。

苯所致造血毒性和白血病的分子機(jī)制尚未被闡明。拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoismerase，TOPO)的研究近年來(lái)受到關(guān)注[3-4]。本課題組的前期研究顯示，苯及其代謝物影響骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOⅡα啟動(dòng)子組蛋白的化學(xué)修飾改變，導(dǎo)致TOPOⅡα表達(dá)及活性下降可能參與了苯所致的造血毒性[3, 5-6]。c-Myb是TOPOⅡα啟動(dòng)子的重要調(diào)控因子，能明顯增加TOPOⅡα的表達(dá)[7]。本研究探討職業(yè)性苯中毒造血損傷中c-Myb的改變及與組蛋白化學(xué)修飾變化的關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者組蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)活性的改變，證實(shí)c-Myb可能通過(guò)組蛋白乙?；揎椀母淖?cè)诼殬I(yè)性苯中毒造血損傷中發(fā)揮作用，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)苯中毒造血損傷的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

材料和方法

1對(duì)象

實(shí)驗(yàn)組的骨髓標(biāo)本25份取自職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者，男性9例，女性16例，平均年齡32.5歲(20～56歲)，平均觸苯時(shí)間≥6月(6月～5年)。工作環(huán)境中平均苯濃度為87mg/m3(50～1 000mg/m3)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)美國(guó)政府工業(yè)衛(wèi)生專家協(xié)會(huì)規(guī)定的最高時(shí)間加權(quán)平均容許濃度(permissibleconcentration-timeweightedaverage,PC-TWA)及短時(shí)間接觸容許濃度(pemissibleconcentration-shorttermexposurelimit,PC-STEL)。對(duì)照組的骨髓標(biāo)本25份取自年齡、吸煙、飲酒習(xí)慣等匹配的健康志愿者，男性11例，女性14例；平均年齡33.8歲(19～58歲)。苯中毒再生障礙性貧血患者根據(jù)GBZ68-2002《職業(yè)性苯中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》診斷。本研究已通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的認(rèn)證。所有骨髓捐獻(xiàn)者均簽署知情同意書(shū)。

2主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)；淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心)；染色質(zhì)免疫沉淀(chromatinimmunoprecipiation，ChIP) 分析試劑盒、抗乙?；M蛋白H3抗體、抗乙?；M蛋白H4抗體、抗二甲基組蛋白H3(K9)抗體和抗三甲基組蛋白H3(K4)抗體(Upstate)；體積分?jǐn)?shù)為37%的甲醛(Sigma)；蛋白酶抑制劑(Calbiochem)；TRIzol和PlatinumRPCRSuperMix(Invitrogen)；RT-PCR試劑盒、GeneRulerTM50bpDNALadder(MBIFermentas)；核蛋白提取試劑盒(Thermo)；HDAC活性測(cè)定試劑盒(Millipore)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

3主要方法

3.1骨髓單核細(xì)胞懸液的制備取職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者及健康志愿獻(xiàn)髓員的骨髓5mL，肝素(5×104U/L)抗凝，骨髓標(biāo)本與RPMI-1640液1∶1混勻后，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法(2 000r/min離心10min)分離單個(gè)核細(xì)胞層，制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液。臺(tái)盼蘭染色檢測(cè)活細(xì)胞率，要求拒染率達(dá)95%以上。骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×109/L。

3.2ChIP檢測(cè)ChIP檢測(cè)按ChIP分析試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。分別在培養(yǎng)液中直接加入37 %的甲醛，使最終濃度為1 %，37 ℃固定10min, 以交聯(lián)組蛋白和DNA。加入含有蛋白酶抑制劑的SDS細(xì)胞裂解液200μL重懸細(xì)胞, 冰上孵育10min，用超聲將DNA打碎成250～1 000bp(此處提取的DNA片段命名為inputDNA)。用特異性抗體[抗乙?；M蛋白H3抗體、抗乙酰化組蛋白H4抗體、抗二甲基組蛋白H3(K9)抗體、抗三甲基組蛋白H3(K4)抗體]沉淀DNA-蛋白復(fù)合物, 用蛋白A瓊脂吸附復(fù)合物, 低鹽免疫復(fù)合體洗液、高鹽免疫復(fù)合體洗液、LiCl免疫復(fù)合體洗液、TE緩沖液洗去非特異性吸附后, 加入5moL/LNaCl65 ℃置4h以解除蛋白/DNA交聯(lián)，沉淀的DNA片段-20 ℃保存?zhèn)溆?此DNA片段命名為ChIPedDNA)。ChIPedDNA通過(guò)PCR法對(duì)目標(biāo)基因(c-Myb)進(jìn)行分析。

3.3c-MybDNA水平的檢測(cè)針對(duì)c-Myb的DNA序列設(shè)計(jì)引物(表1)。將各組得到的ChIPedDNA分別加入上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為:PCRSuperMix12μL，調(diào)控因子上游引物 0.5μL，調(diào)控因子下游引物 0.5μL，上述制得的模板DNA2μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5min；94 ℃ 30s，62 ℃ 30s，72 ℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10min，4 ℃ 30min。反應(yīng)完成后用1.8%瓊脂糖凝膠電泳并照相，QuantityOne圖像分析系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。c-Myb水平變化=(IP苯中毒組/Input苯中毒組)/(IP對(duì)照組/Input對(duì)照組)。

3.4c-Myb的mRNA水平檢測(cè)(1)RNA的提取及cDNA合成：采用TRIzoL法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA的純度及濃度(A260/A280居于1.8～2.0之間認(rèn)為合格)。采用隨機(jī)引物法合成cDNA。(2)針對(duì)撲異構(gòu)酶Ⅱα啟動(dòng)子調(diào)控因子c-Myb的mRNA序列設(shè)計(jì)引物，引物與GenBank基因序列核對(duì)無(wú)誤；采用β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)作為內(nèi)參照(表1)。(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:PCRSuperMix12μL，上游引物 0.5μL，下游引物 0.5μL，cDNA2μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 5min；95 ℃ 30s，53 ℃(c-Myb)或52 ℃(β2-MG) 30s，72 ℃ 30s，35個(gè)循環(huán);72 ℃10min。經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，QuantityOne圖像分析系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以目標(biāo)基因與β2-MG擴(kuò)增產(chǎn)物吸光度值的比值計(jì)算表達(dá)水平。

表1　引物序列

3.5核蛋白的提取分別收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，等滲PBS液洗2遍；按照Thermo核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提，骨髓單個(gè)核細(xì)胞離心沉淀后，依次加入CERⅠ液、CERⅡ液劇烈振蕩、冰浴后離心，棄上清，加NER液劇烈振蕩、冰浴后離心，上清液系胞核蛋白。提取的核蛋白用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度后-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.6HDAC活性測(cè)定按照HDAC活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用試劑盒所配套的96孔板，各孔加入 2×HDAC assay buffer 10 μL，各待測(cè)樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各20 μL，吹打混勻后加入4 mmoL/L HDAC substrate 10 μL，37 ℃孵育60～70 min；稀釋activator solution 液20 μL，37 ℃放置10～20 min。在酶標(biāo)儀405 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)復(fù)孔3個(gè)，取平均值為最終結(jié)果。HDAC的活性=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照A值)/蛋白含量(μg)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，t檢驗(yàn)來(lái)確定兩組之間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1苯中毒對(duì)c-Myb結(jié)合的組蛋白化學(xué)修飾改變的影響

1.1與乙?；M蛋白H4結(jié)合的c-Myb水平臨床苯中毒病例組c-Myb與乙?；M蛋白H4結(jié)合的水平較正常對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見(jiàn)圖1、3。

1.2與乙?；M蛋白H3結(jié)合的c-Myb水平臨床苯中毒病例組c-Myb與乙?；M蛋白H3結(jié)合的水平較正常對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見(jiàn)圖1、3。

1.3與甲基化組蛋白H3K4結(jié)合的c-Myb水平臨床苯中毒病例組c-Myb與甲基化組蛋白H3K4結(jié)合的水平較正常對(duì)照組無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2、3。

1.4與甲基化組蛋白H3K9結(jié)合的c-Myb水平臨床苯中毒病例組c-Myb與甲基化組蛋白H3K9結(jié)合的水平較正常對(duì)照組無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2、3。

2苯中毒對(duì)c-Myb mRNA表達(dá)水平的影響

臨床苯中毒病例組c-Myb的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 1.The levels of c-Myb binding to acetylated histone detected by ChIP analysis. M: marker; 1: input control; 2: IP control; 3: input benzene; 4: IP benzene.

圖1乙酰化組蛋白結(jié)合的c-Myb

Figure 2.The levels of c-Myb binding to methylated histone detected by ChIP analysis. M: marker; 1: input control; 2: IP control; 3: input benzene; 4: IP benzene.

圖2甲基化組蛋白結(jié)合的c-Myb

Figure 3.Changes of c-Myb binding levels to histones modified by acetylation and methylation. Mean±SD. n=5.**P<0.01 vs control.

圖3c-Myb 結(jié)合的組蛋白乙?；图谆揎椝降淖兓?/p>

Figure 4.The mRNA expression of c-Myb detected by RT-PCR. Mean±SD. n=5.*P<0.05 vs control.

圖4RT-PCR檢測(cè)c-Myb 的mRNA水平

3苯中毒對(duì)HDAC活性的影響

臨床苯中毒病例組HDAC活性較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.HDAC activity of bone marrow mononuclear cells. Mean±SD.n=10.*P<0.05 vs control.

圖5骨髓單個(gè)核細(xì)胞HDAC活性

討論

近年來(lái)，苯所致造血毒性已得到廣泛的重視，但其毒性機(jī)制仍遠(yuǎn)未闡明，脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞凋亡、DNA損傷、細(xì)胞微環(huán)境受損、免疫異常均是其可能機(jī)制之一[8-10]。自1996年Frantz等首次提出苯的活性代謝產(chǎn)物抑制TOPOⅡ活性開(kāi)始，TOPO在苯所致造血毒性中的作用日漸明確[3-4]。

表觀基因機(jī)制在腫瘤的發(fā)生機(jī)制中有著與基因突變機(jī)制同等重要的作用。組蛋白的共價(jià)修飾是表觀基因機(jī)制的重要內(nèi)容, 參與調(diào)控多種生物學(xué)事件，主要包括組蛋白乙?；⒔M蛋白甲基化、DNA甲基化和染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)中其它成分的修飾。組蛋白乙酰化、甲基化可直接影響一系列細(xì)胞核內(nèi)生物過(guò)程，包括基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制和染色體組裝，調(diào)控基因的表達(dá)[11]。組蛋白乙?；c基因轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)[12]，去乙?；Ｒ?jiàn)基因轉(zhuǎn)錄沉默[13]，而組蛋白甲基化的功能則因氨基酸殘基類(lèi)別和它們?cè)诮M蛋白尾端的位置不同而不盡相同[12]，組蛋白H3K4甲基化與基因轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)，而組蛋白H3K9甲基化常見(jiàn)基因轉(zhuǎn)錄沉默[14]。

ChIP技術(shù)是一種在體內(nèi)研究DNA和蛋白質(zhì)相互作用的方法，能夠較真實(shí)地反映體內(nèi)染色質(zhì)與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合情況，被大量應(yīng)用于其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如CRE結(jié)合蛋白[15]及c-Myc等對(duì)其靶基因表達(dá)的調(diào)控分析。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)苯所致造血毒性與TOPOⅡα的表達(dá)(含量、活性)下降相關(guān)，而TOPOⅡα啟動(dòng)子組蛋白乙?；?、甲基化化學(xué)修飾改變是其表達(dá)下降的機(jī)制之一[3,5-6]。在此基礎(chǔ)上，本課題組借助ChIP技術(shù)進(jìn)一步研究TOPOⅡα啟動(dòng)子調(diào)控因子組蛋白化學(xué)修飾改變?cè)诼殬I(yè)性苯中毒造血損傷機(jī)制中發(fā)揮的作用[16]。

c-Myb是TOPOⅡα啟動(dòng)子重要的調(diào)控因子，在TOPOⅡα啟動(dòng)子近端的5’區(qū)存在c-Myb的結(jié)合位點(diǎn)[17]，c-Myb通過(guò)與c-Myb結(jié)合位點(diǎn)(-16至-11位點(diǎn))結(jié)合，激活TOPOⅡα的表達(dá)[7]。我們針對(duì)c-Myb設(shè)計(jì)了相應(yīng)的適合ChIP后產(chǎn)物的引物，來(lái)觀察其水平的改變。研究發(fā)現(xiàn)，職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者c-Myb結(jié)合的組蛋白乙?；揎椝浇档?，c-Myb的mRNA表達(dá)水平下降，提示c-Myb結(jié)合的組蛋白乙?；降母淖兛赡軈⑴c了TOPOⅡα表達(dá)的降低。

組蛋白乙?；绞且粋€(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，由HDAC和組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferases，HAT)共同調(diào)控。Sonnemann等[18]通過(guò)臨床收集各種血液腫瘤標(biāo)本，進(jìn)行HDAC活性測(cè)定，研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)低乙?；脚cHDAC活性增高有關(guān)，而與HAT活性降低關(guān)系不大。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了HDAC活性檢測(cè)。研究結(jié)果顯示職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者HADC活性較對(duì)照組明顯升高，提示苯及其代謝產(chǎn)物不僅影響染色質(zhì)的表觀遺傳學(xué)及后續(xù)的基因表達(dá)，也切實(shí)影響了表觀遺傳學(xué)調(diào)控酶的活性，與組蛋白化學(xué)修飾改變平行，為c-Myb結(jié)合的組蛋白乙?；礁淖儏⑴cTOPOⅡα表達(dá)減低提供了一定的依據(jù)，極大地支持并論證了本課題組提出的組蛋白化學(xué)修飾水平改變?cè)诼殬I(yè)性苯中毒造血損傷中發(fā)揮作用的假說(shuō)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of c-Myb binding levels to histones modified by acetylation and methylation on hematopoietic damnification in occupational benzene poisoning patients

SHI Yi-fen, CHEN Jing-jing, YU Kang

(Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325015, China. E-mail: yukang62@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of histone modification in the changes of topoisomerase Ⅱα promoter regulatory factor c-Myb binding to histone in the occupational benzene poisoning patients with hematopoietic damnification.METHODS: The bone marrow samples were collected from 25 aplastic anemia patients caused by occupational benzene poisoning and 25 healthy controls. The binding levels of c-Myb to the histone with acetylation or methylation were detected by the technique of chromatin immunoprecipitation (ChIP). The mRNA expression of c-Myb was detected by RT-PCR. The activity of histone deacetylase (HDAC) was measured by the colorimetric HDAC assay kit.RESULTS: Compared with the controls, the binding levels of c-Myb to the acetylated histone H4 and acetylated histone H3 in the occupational benzene poisoning patients decreased (P<0.01), while those to the methylated histone H3K4 and methylated histone H3K9 didn’t obviously change. The mRNA expression of c-Myb in the occupational benzene poisoning patients was significantly down-regulated compared with the controls (P<0.05).The HDAC activity of the bone marrow mononuclear cells in the occupational benzene poisoning patients increased obviously (P<0.05).CONCLUSION: Topoisomerase Ⅱα promoter regulatory factor c-Myb may play an important role in the hematopoietic toxicities of benzene through histone acetylation modification.

[KEY WORDS]Benzene; c-Myb; Histone acetylation; Histone methylation; Chromatin immunoprecipitation; Histone deacetylase

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)05- 0907- 05

[收稿日期]2016- 01- 18[修回日期] 2016- 03- 02

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81172613；No. 81502793)；溫州市科委基金資助項(xiàng)目(No. Y20120004； No. Y20150034)

通訊作者△Tel: 0577-55579489； E-mail: yukang62@126.com

[中圖分類(lèi)號(hào)]R135.1； R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.023

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