劉賀賀,蔣紅霞,富　貴,白世俊,包錦淵,韋梅琴,李軍喬

(1.青海民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，西寧　810007；2.青海省生物技術(shù)與分析測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧　810007；3.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧　810016)

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青藏高原蕨麻種質(zhì)資源遺傳多樣性POD同工酶分析

劉賀賀1,2,蔣紅霞1,2,富貴1,2,白世俊1,2,包錦淵1,2,韋梅琴3,李軍喬1,2

(1.青海民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，西寧810007；2.青海省生物技術(shù)與分析測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810007；3.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧810016)

摘要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析75份蕨麻過氧化物同工酶，結(jié)果與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞水平、分子標(biāo)記研究的結(jié)果一致，顯示蕨麻的遺傳多樣性豐富。證實(shí)蕨麻具有豐富遺傳變異,為合理保護(hù)與科學(xué)利用蕨麻資源提供科學(xué)依據(jù)。檢測(cè)顯示,蕨麻葉片過氧化物同工酶電泳共出現(xiàn)14條酶帶；酶帶多態(tài)位點(diǎn)百分率為100%；NTSYSpc 2.1軟件計(jì)算的遺傳相似系數(shù)為0.214～1.000，平均值為0.681；以遺傳相似系數(shù)為基礎(chǔ)，采用非加權(quán)類平均法進(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)為0.67時(shí)分為2大類，第1類為蕨麻，第2類為鵝絨委陵菜。蕨麻種質(zhì)資源遺傳多樣性及遺傳變異均較豐富。說明，蕨麻豐富的遺傳多樣性是在青藏高原復(fù)雜的地理環(huán)境中長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果。

關(guān)鍵詞蕨麻；遺傳多樣性；過氧化物同工酶；聚丙烯酰胺凝膠電泳；相似系數(shù)；多態(tài)位點(diǎn)百分率

蕨麻(Potentillaanserina)屬薔薇科委陵菜屬(Potentilla)，是鵝絨委陵菜(PotentillaanserinaL.)的變種，以葉為鋸齒狀奇數(shù)羽狀復(fù)葉，匍匐莖，單生小花，多年生草本植物為特征，因葉片被有白色絨毛而得名，生河岸、路邊、山坡草地及草甸，海拔500～4 100 m，在甘肅、青海、西藏高寒地區(qū)，根部膨大，含豐富淀粉[1]。蕨麻是藥食兼用的保健品，能夠提高機(jī)體免疫能力，具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗菌、抗病毒、抗真菌、抑制腫瘤、保肝護(hù)肝、降低血脂及膽固醇等功效[2]。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類上，塊根膨大的為蕨麻，塊根不膨大的為鵝絨委陵菜。

種質(zhì)資源是遺傳育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的正確評(píng)價(jià)是合理利用種質(zhì)資源的前提。遺傳多樣性是確保物種延續(xù)和不斷進(jìn)化的關(guān)鍵，開展蕨麻遺傳多樣性研究，對(duì)蕨麻品種擴(kuò)大遺傳基礎(chǔ)和選育新品種均有重要作用。2010年開始，蕨麻研究中心利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)研究和分子標(biāo)記的方法研究蕨麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性，表明蕨麻不僅具有豐富的遺傳多樣性，而且蕨麻的遺傳變異較高。通常情況下，植物的表現(xiàn)型與基因型一致，3種方法分析顯示大部分的蕨麻材料同樣符合這一規(guī)律，少數(shù)蕨麻材料存在不一致的情況，為證實(shí)差異的存在，筆者應(yīng)用生理生化標(biāo)記的方法研究蕨麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

同工酶的酶譜同等位基因之間有明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此成為一種十分有效的遺傳多樣性的檢測(cè)標(biāo)記[3-4]。 同工酶分析技術(shù)從蛋白質(zhì)水平反映物種的遺傳差異，且材料來源豐富、實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)單、結(jié)果易于比較，是一種十分有效的遺傳標(biāo)記[5]。丁玲等[6-7]、沈鏑等[8]和易剛強(qiáng)等[9]采用同工酶的方法分析了菊花、芋和梔子的遺傳多樣性，得到理想的結(jié)果。本試驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，分析75份蕨麻種質(zhì)資源進(jìn)行過氧化物同工酶(POD)酶譜差異研究，從蛋白質(zhì)水平上對(duì)遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期進(jìn)一步證實(shí)蕨麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性及復(fù)雜的遺傳變異，為合理保護(hù)與科學(xué)利用蕨麻資源提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

蕨麻分布廣泛，生長(zhǎng)區(qū)域地理氣候條件差別較大，很難同時(shí)采集到不同地區(qū)同一個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)的野生蕨麻，課題組為了規(guī)避這一問題，從2008年開始逐步采集中國(guó)各地區(qū)的蕨麻進(jìn)行移栽，目前已在青海省互助縣、湟源縣分別建立了2個(gè)蕨麻種質(zhì)資源圃，共有種質(zhì)資源128份。有些地區(qū)的蕨麻種質(zhì)資源剛剛成活或植株僅有1～2株，故選擇有一定區(qū)域代表性且生長(zhǎng)旺盛的75份種質(zhì)資源進(jìn)行同工酶測(cè)定。選取的75份蕨麻種質(zhì)資源材料詳見表1。

取幼苗期生長(zhǎng)健壯的健康完整植株，剪取幼嫩葉片1.0～2.0 g，使用蒸餾水簡(jiǎn)單沖洗葉片上的泥土和其他雜物，放入冰盒內(nèi)低溫保存。采集當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室，放入4℃冰箱內(nèi)遮光保存，3 d內(nèi)完成同工酶的提取。

表1　供試蕨麻種質(zhì)材料

(續(xù)表1Continued table 1)

序號(hào)No.樣品編號(hào)Samplenumber地點(diǎn)Location海拔/mAltitude經(jīng)度Longitude緯度Latitude塊根是否膨大Swollenrhizomeornot40化隆-02 Hualong-02青海海東 HaidongQinghai2621102°17.295'E36°02.487'N否 No41興海-01 Xinghai-01青海海南州 HainanQinghai344699°55.883'E35°39.998'N否 No42興海-02 Xinghai-02青海海南州 HainanQinghai345399°55.908'E35°39.970'N是 Yes43貴德-02 Guide-02青海海南州 HainanQinghai2795101°19.588'E35°51.040'N否 No44貴南-01 Guinan-01青海海南州 HainanQinghai3359101°05.599'E35°30.091'N是 Yes45河南-03 Henan-03青海黃南州 HuangnanQinghai3566101°42.719'E34°42.876'N是 Yes46河南-04 Henan-04青海黃南州 HuangnanQinghai3625101°47.097'E34°37.760'N是 Yes47久治-01 Jiuzhi-01青海果洛州 GuoluoQinghai3983101°05.663'E33°25.852'N是 Yes48久治-02 Jiuzhi-02青海果洛州 GuoluoQinghai3869101°18.054'E33°23.342'N是 Yes49久治-03 Jiuzhi-03青海果洛州 GuoluoQinghai3631101°28.321'E33°25.508'N是 Yes50平安-02 Ping`an-02青海海東 HaidongQinghai3266101°20.528'E37°37.522'N否 No51湟源-01 Huangyuan-01青海海北州 HaibeiQinghai2927101°01.570'E36°51.399'N否 No52湟源-02 Huangyuan-02青海海北州 HaibeiQinghai2915101°11.165'E36°32.503'N否 No53祁連-灰葉 Qilian-Greyleaf青海海北州 HaibeiQinghai2928100°23.006'E38°04.296'N否 No54祁連-04 Qilian-04青海海北州 HaibeiQinghai3634100°13.359'E38°03.005'N是 Yes55循化-01 Xunhua-01青海海東 HaidongQinghai2639102°18.535'E35°44.638'N否 No56循化-02 Xunhua-02青海海東 HaidongQinghai3255102°14.507'E35°42.038'N否 No57循化-03 Xunhua-03青海海東 HaidongQinghai2527102°07.121'E35°36.311'N否 No58循化-04 Xunhua-04青海海東 HaidongQinghai2760102°10.442'E35°33.643'N否 No59玉樹-01 Yushu-01青海玉樹州 YushuQinghai422596°34.639'E33°12.087'N是 Yes60玉樹-02 Yushu-02青海玉樹州 YushuQinghai444496°42.716'E33°07.125'N是 Yes61玉樹-13 Yushu-03青海玉樹州 YushuQinghai421196°45.528'E32°53.083'N否 No62玉樹-18 Yushu-18青海玉樹州 YushuQinghai377897°04.816'E33°22.243'N是 Yes63玉樹-20 Yushu-20青海玉樹州 YushuQinghai446197°13.785'E33°20.760'N是 Yes64黃南-03 Huangnan-03青海黃南州 HuangnanQinghai3821101°26.603'E36°21.428'N是 Yes65黃南-04 Huangnan-04青海黃南州 HuangnanQinghai2909101°33.078'E36°16.371'N否 No66黃南-05 Huangnan-05青海黃南州 HuangnanQinghai2795101°19.588'E35°51.040'N否 No67黃南-06 Huangnan-06青海黃南州 HuangnanQinghai2795101°19.588'E35°51.040'N否 No68黃南-07 Huangnan-07青海黃南州 HuangnanQinghai3359101°05.599'E35°30.091'N是 Yes69黃南-08 Huangnan-08青海黃南州 HuangnanQinghai3292100°59.647'E35°30.529'N是 Yes70黃南-09 Huangnan-09青海黃南州 HuangnanQinghai3290100°44.773'E35°14.590'N是 Yes71黃南-10 Huangnan-10青海黃南州 HuangnanQinghai3371100°52.105'E35°12.951'N否 No72甘德-01 Gande-01青海果洛州 GuoluoQinghai4225100°05.053'E34°03.436'N是 Yes73甘德-02 Gande-02青海果洛州 GuoluoQinghai404599°53.085'E34°57.463'N是 Yes74達(dá)日-02 Dari-02青海果洛州 GuoluoQinghai402899°48.116'E33°37.535'N是 Yes75大通-02 Datong-02青海海北州 HaibeiQinghai2898101°27.368'E37°14.432'N否 No

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1酶液的制備稱蕨麻葉片1.0 g，蒸餾水沖洗3次，濾紙吸干后剪碎。放入4 ℃預(yù)冷的研缽中，加入2 mL 0.1 mol/L 的Tris-HCl(pH 8.9)的酶液提取液，冰浴下研磨至勻漿。低溫提取1 h，轉(zhuǎn)移至離心管中離心，4 ℃下10 000 r/min 離心15 min。取上清液，加等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的蔗糖溶液，混勻后置4 ℃ 冰箱保存，備用。

1.2.2凝膠制備采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠板厚度為1.5 mm。分離膠質(zhì)量濃度70 g/L，凝膠母液[6](表2)按A∶C∶G∶水=4∶5∶8∶4.5(G儲(chǔ)備液當(dāng)天配制)的體積比混勻，混勻后從上部一側(cè)緩緩加入凝膠，約占整個(gè)膠板的3/4，加入過程中防止氣泡的產(chǎn)生。為保持膠面的平整，在上面加一層雙蒸水。在日光燈下凝聚，1 h 后當(dāng)水面與膠面出現(xiàn)明顯界面時(shí)說明分離膠凝聚完成。用吸水紙吸去膠面上的水，加入濃縮膠，濃縮膠質(zhì)量濃度為50 g/L，凝膠儲(chǔ)備液按B∶D∶E=2∶3∶4的體積比混勻。加完濃縮膠后插上梳子，日光燈下凝聚，1 h后濃縮膠凝聚完成。

1.2.3電 泳待膠完全凝聚后，取下梳子，加樣電泳。每樣孔進(jìn)樣量20 μL，以溴酚藍(lán)為指示劑。電泳槽內(nèi)加入pH 8.3的Tris-Gly電極緩沖液約500 mL，4 ℃冰箱中恒溫電泳。電泳初始電壓150 V，溴酚藍(lán)電泳至分離膠時(shí)穩(wěn)壓300 V。溴酚藍(lán)電泳到分離膠底端1 cm處時(shí)，停止電泳。

1.2.4染 色POD同工酶顯色參考胡能書等[11]和郭堯君[12]采用的醋酸聯(lián)苯胺法，并進(jìn)行改良。電泳完畢，小心剝?nèi)∧z用蒸餾水漂洗數(shù)次，置醋酸聯(lián)苯胺染液5～10 min，出現(xiàn)清晰過氧化物酶帶后迅速倒出染液，蒸餾水洗數(shù)次，拍照、保存。染液配制：將1 g聯(lián)苯胺溶于9 mL冰醋酸中，再加36 mL蒸餾水，混勻配成聯(lián)苯胺溶液。使用時(shí)取5 mL聯(lián)苯胺溶液，2 mL 30 g/L的H2O2，93 mL蒸餾水，混勻。

1.3數(shù)據(jù)處理

凝膠板上酶譜帶顏色深淺反應(yīng)同工酶活性的強(qiáng)弱。根據(jù)電泳圖(圖1)，將酶活性分為強(qiáng)、較強(qiáng)、弱3個(gè)等級(jí)，繪制電泳模式圖(圖2)。分別計(jì)算酶帶遷移率(Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離)。根據(jù)電泳模式圖將酶帶分布情況轉(zhuǎn)化為0，1二態(tài)性數(shù)值，有酶帶記為“1”，無酶帶記為“0”，建立POD同工酶譜帶的相對(duì)遷移率和二態(tài)數(shù)據(jù)。

表2　 凝膠儲(chǔ)備液配方

圖1　75份蕨麻過氧化物同工酶酶譜

圖2　蕨麻過氧化物同工酶模式

計(jì)算各酶的多態(tài)位點(diǎn)百分率[13](Percentage of Polymorphic Bands，PPB)，PPB=NPB/TNB×100 %，式中，NPB(Number of Polymorphic Bands)為多態(tài)性條帶數(shù)，TNB( Total Number of Bands)為總條帶數(shù)。使用NTSYSpc 2.1計(jì)算POD酶譜帶的遺傳相似系數(shù)(Genetic Similarity,GS)，計(jì)算公式[14]如下：GS=2a/(2a+b+c)，其中，a為2個(gè)物種群共有的多態(tài)條帶，b為X物種群特有條帶數(shù)，c為Y物種群特有條帶數(shù)。再用非加權(quán)組平均法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Average,UPGMA)進(jìn)行聚類分析并繪制相似系數(shù)樹狀聚類圖。

2結(jié)果與分析

2.1POD同工酶分析

75份蕨麻種質(zhì)資源葉片的POD電泳染色結(jié)果共出現(xiàn)14條酶帶。不同蕨麻材料出現(xiàn)3～10條不同酶帶，77%的材料含有6～9條酶帶，酶帶出現(xiàn)最多的是7號(hào)(日喀則-32)、9號(hào)(那曲-01)、10號(hào)(那曲-02)和69號(hào)(黃南-08)材料，有10條酶帶；出現(xiàn)最少的是52號(hào)(湟源-02)和71號(hào)(甘德-01)材料，僅有3條酶帶。

14條酶帶分別用POD-1、POD-2、POD-3、POD-4……POD-14表示，Rf值為0.103～0.793。根據(jù)酶帶的遷移率的大小，分為Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)、Ⅲ區(qū)。Ⅰ區(qū)(Rf<0.207)有4條酶帶，包括POD-1～POD-4；Ⅱ區(qū)(0.3280.466)有5條酶帶，包括POD-5～POD-9；Ⅲ區(qū)(Rf>0.665)有5條酶帶，包括POD-10～POD-14。POD同工酶活性強(qiáng)的條帶在Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)分布較為集中，Ⅲ區(qū)分布較為分散。

酶帶出現(xiàn)率為6.67%～96.00%，遷移率及出現(xiàn)頻率見表3。酶帶POD-1和POD-5的出現(xiàn)率低于10.00%，可作為特異性酶帶，特異性的酶帶是蕨麻材料的遺傳特異性表現(xiàn)，具有較強(qiáng)的特異性。酶帶出現(xiàn)率在80%以上的高頻率有3條酶帶，分別是POD-2(出現(xiàn)率為96%)、POD-7(出現(xiàn)率為93%)和POD-12(出現(xiàn)率為81%)。出現(xiàn)率在30%～80%的中頻率酶帶共6條，占條帶總數(shù)的42.9%。出現(xiàn)率在30%以下的低頻條代數(shù)為5條，占條帶總數(shù)的35.7%，說明POD同工酶的多態(tài)性極高。

按照多態(tài)位點(diǎn)百分率公式，多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)為100%。有72份材料含有酶帶POD-2，有70份材料出現(xiàn)酶帶POD-7，75份蕨麻種質(zhì)資源材料沒有共有條帶，14條酶帶全部為多態(tài)性酶帶，說明酶帶POD-2和POD-7為蕨麻資源POD同工酶比較穩(wěn)定遺傳的酶帶。多態(tài)性酶帶數(shù)和百分率直接反映材料的多態(tài)性，間接反映酶譜的多樣性信息含量，又可作為度量遺傳變異水平高低的指標(biāo)。

2.275份蕨麻種質(zhì)資源的相似系數(shù)

NTSYSpc 2.1軟件計(jì)算75份材料2 850對(duì)兩兩不同材料的相似系數(shù)，結(jié)果見表4。相似系數(shù)為0.214～1.000，平均值為0.681。

蕨麻材料7號(hào)(日喀則-32)與17號(hào)(合作-05)、71號(hào)(黃南-10)、75號(hào)(大通-02)，4號(hào)(林芝-57)與54號(hào)(祁連-04)，14號(hào)(那曲-17)與75(大通-02)號(hào)5組之間，相似系數(shù)最小(GS=0.214)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。同一個(gè)地區(qū)的材料如1號(hào)(林芝-41)和2號(hào)(大武-04)，雖同是來自自西藏林芝地區(qū)達(dá)孜縣，采樣點(diǎn)的不同，其同工酶的種類和酶帶的活性也不完全一樣，相似系數(shù)為0.929。66號(hào)(黃南-05)和67號(hào)(黃南-06)材料同樣來自同一地點(diǎn)，其相似系數(shù)僅為0.786。說明，居群內(nèi)存在著一定的遺傳變異。

表3　蕨麻同工酶酶帶遷移率(Rf)及出現(xiàn)頻率(Af)

表4　蕨麻材料的相似系數(shù)(部分)

注：最上一行及最左側(cè)一列的編號(hào)是樣品編號(hào)。

Note：Numbers of top row and left-most column are sample number.

材料來源較近的8號(hào)(日喀則-34)與12號(hào)(那曲-06)，20號(hào)(碌曲-03)、21號(hào)(碌曲-05)和49號(hào)(久治-03)，41號(hào)(興海-01)、72號(hào)(甘德-01)和73號(hào)(甘德-02)，48號(hào)(久治-02)、60號(hào)(玉樹-02)和61號(hào)(玉樹-13)，50號(hào)(平安-02)、59(玉樹-01)號(hào)和62(玉樹-18)號(hào)兩兩之間13組，地域相距較遠(yuǎn)的材料1號(hào)(林芝-41)與32號(hào)(大武-03)，16號(hào)(合作-01)與44號(hào)(貴南-01)，31號(hào)(大武-01)與45號(hào)(河南-03)，34號(hào)(大武-05)與38號(hào)(拉雞山-02)4組，共17組材料間的相似系數(shù)最大(GS=1.000)，親緣關(guān)系最近?？梢姡赜蛳嗑嘟瓦h(yuǎn)的地區(qū)均存在變異小、親緣關(guān)系近的蕨麻材料。

2.3蕨麻種質(zhì)資源的聚類分析

使用NTSYSPC 2.1軟件進(jìn)行聚類分析，繪制樹狀圖，見圖3。結(jié)果表明，在相似系數(shù)為0.72時(shí)分為5類，第1類包括28份蕨麻材料，其中西藏有11份材料，甘肅有2份材料，青海有15份材料；第2類包括16份蕨麻材料，其中西藏有3份，甘肅有7份，青海有6份；第3類包括7份蕨麻材料，其中甘肅有1份，青海有6份；第4類包括14份蕨麻材料，其中西藏有1份，甘肅有3份，青海有10份；第5類包括10份蕨麻材料，全部來自青海，5份材料來自玉樹，海東和黃南地區(qū)各2份材料，果洛地區(qū)1份材料；第1類與第2類在相似系數(shù)為0.70時(shí)聚為一類即第1大類，親緣關(guān)系相對(duì)較近，44份材料中塊根膨大的36份，為蕨麻。第3類與第4類在相似系數(shù)為0.67時(shí)聚為一類，并在相似系數(shù)為0.74時(shí)與第5類聚為第2大類，31份材料中塊根不膨大的17份，為鵝絨委陵菜。

圖3　75份蕨麻過氧化物同工酶聚類結(jié)果

西藏的15份蕨麻材料中有14份聚在第1大類，15號(hào)(那曲-18)聚類到第2大類。甘肅的13份材料有9份材料也聚在第1大類，其余4份材料聚類到第2大類，47份青海的蕨麻材料在第1大類中有20份，第2大類中有26份?？梢?，蕨麻的種質(zhì)資源中遺傳差異最大的是青海，其次是甘肅，最小是西藏。海拔3 000 m的18份材料，6份聚類到第1大類，12份聚類到第2大類，海拔3 000～4 000 m的材料和海拔4 000 m以上的材料也出現(xiàn)類似情況，且在第2大類中均有分布。

3結(jié)論與討論

3.1蕨麻種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富

遺傳多樣性包括一個(gè)物種所有個(gè)體間遺傳變異的總和，是居群生存和發(fā)展的前提[15]。遺傳變異是種群長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境變化的結(jié)果，遺傳多樣性丟失導(dǎo)致小種群對(duì)環(huán)境變化(如污染、氣候變化)的響應(yīng)能力非常有限[16]。蕨麻研究中心采用的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)研究和分子標(biāo)記的方法研究表明蕨麻種質(zhì)資源多樣性豐富。多態(tài)性酶帶數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率可以直接反映材料的多態(tài)性，間接反映酶譜的多樣性信息含量，還可作為度量遺傳變異水平高低的指標(biāo)。相似系數(shù)可用來比較群體或個(gè)體間相似程度的度量參數(shù)，相似系數(shù)越高，說明相似程度越大，遺傳背景相似性越強(qiáng)[17]。本試驗(yàn)使用生化標(biāo)記的方法揭示蕨麻14條POD同工酶酶帶全部為多態(tài)性酶帶數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)到最大100%，顯示蕨麻種質(zhì)遺傳多樣性豐富，與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)研究和分子標(biāo)記的研究結(jié)果一致。

研究顯示，75份蕨麻材料的14條POD同工酶酶帶中無共同酶帶，未檢測(cè)到同工酶酶帶及活性完全一致的材料。僅有部分材料，如1號(hào)(林芝-41)與32號(hào)(大武-03)等17組材料的相似系數(shù)為1.000，僅具有相同的酶帶及酶帶條數(shù)，酶帶的活性并不一致，可見，蕨麻種質(zhì)資源的豐富性使不同地區(qū)間的蕨麻材料存在一定差異，這與蕨麻廣闊的生態(tài)適應(yīng)性相一致。因而蕨麻在食用、藥用及生態(tài)應(yīng)用上的開發(fā)前景巨大，在研究、利用和保護(hù)野生蕨麻種質(zhì)資源時(shí)，應(yīng)注意不同地區(qū)和居群的代表性。

3.2蕨麻種質(zhì)資源親緣關(guān)系復(fù)雜

本試驗(yàn)聚類結(jié)果顯示，50份蕨麻材料中僅有36份聚為蕨麻一類，剩余的14份聚到鵝絨委陵菜一類中，25份鵝絨委陵菜材料中17份聚到鵝絨委陵菜類中，此聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記的聚類結(jié)果——不同比例的蕨麻材料聚到鵝絨委陵菜中的結(jié)果一致。在采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)的蕨麻性狀也存在較大的差異，在甘肅臨潭蕨麻原變種和灰葉蕨麻變種共同生長(zhǎng)，在多數(shù)采樣地，甚至同一株蕨麻，其塊根的性狀及色澤都不盡相同。表明蕨麻的遺傳變異高、遺傳關(guān)系復(fù)雜。蕨麻的表型是環(huán)境是基因決定還是由二者共同決定，需要進(jìn)一步深入研究。

蕨麻這種遺傳復(fù)雜的關(guān)系是長(zhǎng)期在復(fù)雜的地理環(huán)境中適應(yīng)的結(jié)果，使得蕨麻能在環(huán)境復(fù)雜的情況下正常生長(zhǎng)發(fā)育繁殖。同樣，人們能夠獲得不同品質(zhì)的蕨麻資源，也為遺傳育種提供了豐富變異。

目前研究表明，許多植物在冰期時(shí)存在避難所，而在最后一次大冰期后，不同的植物甚至同種植物的不同種群表現(xiàn)不同的進(jìn)化反應(yīng)(擴(kuò)張或者不擴(kuò)張)，這些研究為植物分布區(qū)中心和邊緣，種群繁殖分配策略的比較研究提供了基礎(chǔ)[18-20]。蕨麻在青藏高原廣泛分布，與其他許多植物一樣在冰川時(shí)期存在避難所。本試驗(yàn)研究的蕨麻材料來自中國(guó)三大自然區(qū)之一的青藏高原，其自然環(huán)境的垂直變化和水平分異與低海拔區(qū)域迥然不同，具有獨(dú)特的地生態(tài)現(xiàn)象及其空間格局。目前報(bào)道的36種高山植物的譜系地理分析顯示，譜系地理模式主要表現(xiàn)為：一、冰期退卻到高原邊緣的避難所，冰后期回遷到高原面；二、地理隔離造成冰期存在多處避難所(含微型避難所)，冰后期發(fā)生局域性擴(kuò)張[21-22]。由蕨麻復(fù)雜的親緣關(guān)系推測(cè)蕨麻的譜系地理模式為上述的第2種，即蕨麻在冰川時(shí)期就地尋找避難所，躲過了嚴(yán)酷的環(huán)境條件，并在冰川時(shí)期結(jié)束后逐漸分布青藏高原。生境變化較小的蕨麻發(fā)生較小甚至不發(fā)生變異，保持了較為原始生長(zhǎng)類型，生境變化大的蕨麻材料發(fā)生了較大的變異。

青藏高原及其周圍地區(qū)，由于特殊的環(huán)境條件使得蕨麻在青藏高原的分布一直處于野生狀態(tài)，為了生存繁衍，蕨麻需要適應(yīng)各種不同的微環(huán)境，環(huán)境的變化影響蕨麻同工酶基因的表達(dá)，惡劣的環(huán)境條件是導(dǎo)致蕨麻表現(xiàn)豐富的遺傳多樣性的重要原因。

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Received 2015-04-08Returned2015-06-24

Foundation itemTransformation Fund in Agricultural Sci-tech Achievement of Ministry of Science and Technology (No.2010GB2G00514); NNSF of China (No.30607026,No.30660019); Fund Project in Natural Science of Qinghai Province(No.2012-Z-907).

First authorLIU Hehe,male,master student.Research area:medicinal plant resourcesdevelopment and utilization.E-mail:516098384@qq.com

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕Responsible editor:PAN Xueyan)

Genetic Diversity ofPotentillaanserinain Qinghai-Tibetan Plateau of China Based on Peroxidase Isozyme

LIU Hehe1,2,JIANG Hongxia1,2,FU Gui1,2,BAI Shijun1,2,BAO Jinyuan1,2,WEI Meiqin3and LI Junqiao1,2

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Qinghai University for Nationalities,Xining810007,China;2.Qinghai Provincial Biotechnology and Analytical Test Key Laboratory,Xining810007,China;3 Agriculture and Animal Husbandry College,Qinghai University,Xining810016,China)

AbstractWe used technique of polyacrylamide gel electrophoresto analyze the peroxidase isozyme in 75 Potentilla anserina. The results showed that biochemical markers were consistent with the results in morphological markers,cell level and molecular markers,and Potentilla anserinehad genetic diversity .By peroxidase isoenzyme electrophoresis,we found 14 enzyme bands of Potentilla anserina leaf;percentage of polymorphic bands was 100%;genetic similarity coefficient calculated by the software NTSYSpc 2.1 ranged from 0.214 to 1.000,and the average value was 0.681; Based on the genetic similarity coefficient,cluster analysis was done by method of unweighted pair group method with arithmetic mearns used Potentilla anserina material ,Potentilla anserina was divided into two categories when the genetic similarity was 0.67,the main one of the first category was Potentilla anserina material,the main one in the second category was Potentilla anserine material. In conclusion,rich genetic diversity and variations of Potentilla anserina was caused by evolution in the complicated geographical environment of the Qinghai Tibet Plateau in long time.

Key wordsPotentilla anserina;Genetic diversity;POD isozyme; Polyacryamide gel electrophoresis; Genetic similarity; Percentage of polymorphic bands

Corresponding authorLI Junqiao,female,Ph.D,professor.Research area:medicinal plant resources development and utilization.E-mail:ljqlily2002@126.com

中圖分類號(hào)Q814.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)03-0413-10

通信作者：李軍喬，女，博士，教授，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)與利用。E-mail：ljqlily2002@126.com

基金項(xiàng)目：科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化基金(2010GB2G00514);國(guó)家自然科學(xué)基金(30607026,30660019);青海省自然科學(xué)基金(2012-Z-907)。

收稿日期：2015-04-08修回日期：2015-06-24

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-03-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1611.026.html

第一作者：劉賀賀，男，在讀碩士，研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源開發(fā)與利用。E-mail：516098384@qq.com