彭武建，王紅蕾，黃建溶，戴勇（.深圳市第三人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東 深圳 58000；.南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東廣州 50000；.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 深圳市人民醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 深圳 5800）

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類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者循環(huán)microRNAs生物標志物的篩選及鑒定

彭武建1，王紅蕾2，黃建溶1，戴勇3
（1.深圳市第三人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東 深圳 518000；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東廣州 510000；3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 深圳市人民醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 深圳 518020）

［摘 要］目的：分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者血漿中差異表達的microRNAs（miRNAs）。方法：采用miRNA芯片檢測、篩選RA患者與正常人血漿中表達有顯著變化的miRNAs，并采用RT-qPCR技術(shù)對芯片數(shù)據(jù)進行驗證。數(shù)據(jù)處理采用GeneSpring GX軟件，t檢驗和方差分析用于統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果：RA患者與正常人間存在差異的循環(huán)miRNAs共有40個，其中18個上調(diào)，22個下調(diào)。根據(jù)循環(huán)miRNAs在芯片中表達差異的倍數(shù)和潛在的生物學(xué)價值，選取4個miRNAs進行RT-qPCR驗證，候選的miRNAs與正常對照間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），證實芯片結(jié)果可靠性。結(jié)論：RA患者體內(nèi)具有差異表達的循環(huán)miRNAs，這些循環(huán)miRNAs可作為一種潛在的RA候選生物標志物。

［關(guān)鍵詞］類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；微小RNA；芯片；生物標志物

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以外周滑膜關(guān)節(jié)慢性炎性病變、關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)進行性不可逆性破壞為特征的全身性自身免疫性疾?。?］。目前RA的診斷采用1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）修訂的診斷分類標準［2］，符合此標準的患者常已出現(xiàn)嚴重的關(guān)節(jié)破壞，不利于RA的早期診斷。因此，尋找RA特異性的疾病診斷生物標志物尤為重要。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類長約18～25 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達［3］。miRNAs參與免疫功能調(diào)節(jié)過程及自身免疫性疾病的發(fā)生與進展［4-6］。在循環(huán)系統(tǒng)中同樣可以檢測到miRNAs的存在，且血清/血漿中miRNAs在不同的疾病狀態(tài)下存在著差異表達，可作為一類具有潛在價值的用于臨床的生物標志物［7-8］。因此，本研究應(yīng)用miRNA基因芯片檢測RA患者與正常對照組的循環(huán)miRNAs表達譜，分析2組間差異表達miRNAs，進行生物信息學(xué)分析及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證，為進一步研究RA的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

1　對象和方法

1.1對象 收集深圳市人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科35例RA患者，其中男9例，女26例，年齡18～70歲，平均（44.9±11.5）歲。RA診斷符合1987年美國風(fēng)濕協(xié)會修訂的RA診斷標準［2］。RA組患者在接受大劑量糖皮質(zhì)激素、細胞毒性藥物及免疫抑制劑治療前完成標本采集。正常對照組選取30例排除了自身免疫系統(tǒng)疾病、肝腎功能正常的健康體檢者，其中男10例，女20例，年齡26～52歲，平均（42.9±8.7）歲。各組間性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具可比性。先每組取10例，進行芯片初篩，余下病例作為RT-qPCR驗證。研究計劃經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，受試對象均簽署知情同意書。

1.2標本采集及總RNA的抽提和質(zhì)檢 EDTA抗凝管采集新鮮血液，在4 h內(nèi)以2 000×g離心10 min，吸取上層血漿于凍存管中，-80 ℃凍存。按mirVana PARIS試劑盒（Ambion）說明書從600 μL的血漿中抽提總RNA，紫外分光光度計測量A260/A280值，測定濃度。

1.3混合樣本池法檢測循環(huán)miRNAs 按照等量混合的原則，每組10個樣品各取10 ng混合到成100 ng，進行芯片檢測。

1.4樣品標記及雜交 本實驗所用Agilent Human miRNAs microarray Rel 12.0（上海伯豪生物有限公司）涵蓋886個人類相關(guān)miRNAs以及89個人類病毒相關(guān)miRNAs。100 ng總RNA經(jīng)Cy3熒光基團標記及干燥處理后與芯片雜交20 h（55 ℃，20 r/min）。然后進行芯片洗滌、掃描。

1.5芯片圖像采集和數(shù)據(jù)分析 Agilent Feature Extraction（FE）software version 9.5.3軟件提取數(shù)據(jù)。應(yīng)用GeneSpring GX軟件，以Fold change ≥2，P≤0.05標準，篩選RA患者與正常人血漿中差異表達miRNAs。Fold Change指的是將2組數(shù)據(jù)均一化后，用信號值直接計算其差異的倍數(shù)。應(yīng)用TargetScan、microRNA.org、PITA數(shù)據(jù)庫，進行靶基因預(yù)測及GO和KEGG分析。

1.6RT-qPCR驗證 應(yīng)用RT-qPCR對4個顯著性差異表達的miRNAs進行檢測。引物序列如下：miR-16：5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATATT-3’；miR-155： 5’-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGATA-3’；miR-223：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAATAC-3’；miR-451：5’-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTACTG-3’；Cel-lin4：5’-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCTCA AGTG-3’。反應(yīng)體系：5.0 μL cDNA（1∶20），10 μL 2x SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO），1.0 μL的引物補充RNase-free水至20 μL，以Cel-lin4為內(nèi)參，利用RT-qPCR儀（ABI PRISM 7 500 Sequence Detection System，ABI USA）進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)反應(yīng)95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 32 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔct法計算相對表達值［9］。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以±s表示，2組間比較使用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1循環(huán)miRNAs在RA患者血漿中的表達 采用miRNA芯片實驗，發(fā)現(xiàn)在RA患者和正常人血漿中存在著差異表達的miRNAs共有40個，其中18個上調(diào)，22個下調(diào)（見表1）?；谀壳暗难芯?，根據(jù)芯片結(jié)果和miRNAs潛在的價值選取4個miRNAs進行第二階段的驗證。

表1　RA患者與正常對照間血漿差異表達的miRNAs

2.2RT-qPCR驗證差異表達的miRNAs 采用RT-qPCR檢測miR-16、miR-451、miR-223、miR-155在RA患者與正常人血漿中的表達情況（見圖1），其中miR-16、 miR-451和miR-223在RA患者血漿中表達量明顯高于正常對照組（P＜0.05），而miR-155卻低于正常對照組（P＜0.05）。

圖1 循環(huán)miRNAs RT-qPCR驗證結(jié)果

2.3生物信息學(xué)結(jié)果 為了研究miRNAs的生物學(xué)功能，用Target Scan Human Custom（http∶//www. targetsan.org）分別對差異表達的miRNAs進行靶基因預(yù)測。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對靶基因進行Pathway分析，以P＜0.01，至少2個基因存在于該信號傳導(dǎo)通路為限制條件，尋找相關(guān)信號通路，主要有：癌癥相關(guān)通路、調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架通路、泛素介導(dǎo)的蛋白降解通路以及趨化因子信號通路等（見表2）［10］。

3　討論

本實驗利用芯片檢測結(jié)合生物信息學(xué)方法，篩選了RA患者與正常人血漿中差異表達的40個miRNAs。通過對這些差異表達的循環(huán)miRNAs及可能靶基因進行功能分類，進一步推測其對RA的診斷和治療潛在的意義。發(fā)現(xiàn)在RA患者和正常人血漿中存在著差異表達的miRNAs共有40個，其中18個上調(diào)，22個下調(diào)。本實驗中大部分miRNAs表達與文獻［11］報道相符，但有部分miRNAs，如miRNA-146a在本研究中未見表達差異。這可能與芯片敏感性可能是試驗誤差有關(guān)，故需要進行RT-qPCR驗證芯片結(jié)果。根據(jù)芯片中miRNAs的表達倍數(shù)和miRNAs潛在表達意義，本實驗選擇了4個miRNAs進行驗證，其中miR-16、miR-451和miR-223在RA患者血漿中的相對表達上調(diào)，而miR-155表達下調(diào)。候選循環(huán)miRNAs驗證結(jié)果與芯片結(jié)果一致，證明了芯片結(jié)果的可靠性。

表2　KEGG信號通路表

目前發(fā)現(xiàn)miR-451在腫瘤患者中可調(diào)節(jié)細胞的增殖、浸潤和凋亡。研究表明，miR-451抑制通過p38 MAPK抑制中性粒細胞的趨化性，是RA的潛在治療靶點［12］。然而該研究中RA患者的中性粒細胞中miR-451低表達，而本研究顯示循環(huán)miR-451高表達不符合，原因尚有待進一步明確。miR-16家族在特定環(huán)境中可通過調(diào)控cyclin D及CDK等細胞周期相關(guān)基因的表達誘導(dǎo)細胞周期G1期阻滯［13］。敲除內(nèi)源性的miR-16可顯著延長TNF-α mRNA的半衰期［14］。miR-16與RA成纖維細胞增殖及滑膜細胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［11］。miR-155被證實參與炎癥、免疫和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展多種生理病理過程。miR-155抑制間質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1、MMP-1的生成，緩解關(guān)節(jié)組織破壞。miR-155在RA患者滑液中表達水平升高，通過減少Toll受體配體MMP-3和細胞因子表達來達到控制慢性炎癥、減少滑膜組織損害的作用［15-16］。此外，miR-155參與免疫反應(yīng)，在調(diào)節(jié)造血干細胞的活化、增殖和分化，淋巴細胞發(fā)育，T、B細胞免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用［17］。miR-155的異常表達可導(dǎo)致淋巴細胞功能紊亂，發(fā)生自身免疫性疾病。RA患者滑膜組織中的miR-155高表達，它在滑膜組織中控制破骨細胞的分化，提示參與滑膜炎及骨質(zhì)破壞［18］。miR-223也在造血干細胞的分化、粒細胞的分化激活中起著至關(guān)重要的作用［19］。有研究表明，miR-223參與腎移植后急性排斥反應(yīng)［20］。本研究顯示，RA患者中，其血漿循環(huán)miR-16、miR-45、miR-223、miR-155的表達水平顯著差異，它們的表達異常與RA是密切相關(guān)的，盡管具體作用機制尚不完全明確，但有可能成為RA診斷的分子標志物及治療靶標。

本研究同時對靶基因進行了GO分析和Pathway分析，提示RA發(fā)生發(fā)展是個復(fù)雜的過程，涉及到多種信號通路，對任一通路的調(diào)控都可能對治療RA起到重要作用。本研究獲得的差異表達miRNAs的靶基因信號通路分析顯示集中在癌癥相關(guān)通路、調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架通路、泛素介導(dǎo)的蛋白降解通路以及趨化因子信號通路等。如Focal adhesion信號通路與RA相關(guān)［21］，該信號通路與黏著斑有關(guān)。黏著斑是將細胞外基質(zhì)與細胞骨架聯(lián)系起來的多蛋白聚集體，能進行信號傳遞，引發(fā)相應(yīng)的生理、病理反應(yīng)。黏著斑激酶與黏著斑結(jié)合，在整合素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，它與骨代謝、成纖維細胞的擴增及關(guān)節(jié)血管翳的生成有關(guān)［22］。

綜上所述，本研究篩選并驗證了RA患者差異表達的循環(huán)miRNAs，為進一步研究miRNAs在RA發(fā)病機制中的作用及尋找RA特異性診斷生物標志物打下了基礎(chǔ)。但本實驗采用早期芯片，許多新的miRNAs未包含在內(nèi)。此外，樣本數(shù)量有限，仍需要進一步擴大樣本量，監(jiān)測miRNAs在健康人群、RA患者血清的表達來研究驗證實驗結(jié)果的準確性和特異性。

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（本文編輯：吳健敏）

Screening and verification of circulating miRNA biomarkers of rheumatoid arthritis

PENG Wujian1，WANG Honglei2，HUANG Jianrong1，DAI Yong3. 1. Department of Nephrology，the Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen，518020； 2.Department of Nephrology，the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University，Guangzhou，510000； 3.Clinical Medical Research Center of the Second Clinical Medical College ，Shenzhen People’s Hospital，Jinan University，Shenzhen，518020

Abstract:Objective: To analyze the differentl expression of circulating microRNAs （miRNAs） in patients with rheumatoid arthritis （RA）. Methods: MiRNA profiles were performed to determine the differentially expressed miRNAs using RNA obtained from the plasma of patients with RA and healthy controls； to confirm array results，RT-qPCR was used for validation. GeneSpring GX software was to data processing，t-test and one way ANOVA were used for statistical analysis. Results: The array analysis identified 40 （18 upregulated miRNAs and 22 downregulated miRNAs） circulating miRNAs significantly differently expressed between RA and healthy controls，then we detected the candidate miRNAs selected based on fold-change and potential value by RT-qPCR，consistented with the data obtained from the array，the circulating level of candidate miRNAs were significantly differed in patients with RA compared with healthy controls （P＜0.05）. Conclusion: Differently expressed circulating miRNAs can be detected in patients with RA，this study indicates that circulating miRNAs may be used as a potential candidate biomarker of RA.

Key words:rheumatoid arthritis； microRNAs； array； biomarker

作者簡介：彭武建（1976-），男，湖南永順人，主治醫(yī)師，博士。

基金項目：深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研基金資助項目（201402033）。

收稿日期：2016-01-22

［中圖分類號］R593.22

［文獻標志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.005